骆驼奶样布鲁氏菌检测技术

1骆驼奶样布鲁氏菌检测技术规范4缩略语BHQ1：无荧光猝灭基团(Blackholequencher-1)Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacFAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein)PCR：聚合酶链式反应（polymerase25.1超净工作台。5.3微流控系统。5.4高速台式冷冻离心机，可控温至4℃,离心速度可达12000g以上。5.6涡旋震荡仪。5.11高压灭菌锅。播。感染的母骆驼可能在分娩时将布鲁氏菌垂直传播传给新生骆驼。目前，已知有马耳他布鲁氏菌1为隐蔽，增加了诊断的难度，因此通常需要结合多种检测39病原学鉴定9.1细菌的分离：取15mL乳样，2000xg离心15min，用10μL接种环取奶油层2环，接种于TSA或选择9.2菌落观察9.3微流控qPCR采用引物BrqPCR-F/BrqPCR-R、探针BrqPCRprobe对），4），9.3.2.4质控标准9.3.2.5结果判定且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果仍9.3.3微流控检测流程将处理后奶样、磁珠、内标、qPCR摸索后的引物9.4.1主要仪器9.4.2主要耗材9.4.3材料与试剂9.4.4操作步骤9.4.4.1抗原包被9.4.4.2封闭酶标板9.4.4.3加入待检奶样59.4.4.4加入HRP标记兔抗骆驼IgG加入工作浓度的HRP标记兔抗骆驼IgG抗体，100µL/孔，掉封口膜，弃掉孔内液体，每孔加300µL洗涤液，洗涤3次，每次1min，最后一次拍干。9.4.4.5加入底物溶液加入TMB底物溶液，100µL/孔，37℃避光孵育109.4.4.6加入终止液9.4.5质控标准9.4.6结果判定S/P＞0.29，判为奶样布鲁氏菌抗体阳性，S/6A.1基础培养基琼脂15g～20g；蛋白胨10g；氯化钠加水1000mL上述成分混合，加热使琼脂溶化，然后调pH至7.8，再将培养基分装三角瓶中，然后置20磅(1磅≈0.00689MPa)高压灭菌A.2血清葡萄糖培养基A.3选择培养基在1000mL血清葡萄糖培养基中加入下列成分，即为选择若培养羊种布鲁氏菌，需1000ml血清葡萄糖培养基中加入7A液和B液充分混合后即为储备液。储备液应在密封瓶中4℃避光保存，可使用3个月。使用时用蒸馏水按1:40比例将储备液稀释，8引物BrZL-F/MSZL-R（25pmol/µL）、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、pMD-19T质粒、感受态上游引物BrZL-F：5'-TGGCTCGGTTGC下游引物BrZL-R：5'-CGCGCTTGCCTT用胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD-19T克隆载体连接，布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12~16h。筛选出C.5.2根据扩增情况从中选取5~6个点制作适合标准曲线要求的标准9超声波细胞破碎仪，恒温摇床，制冰机，紫外可见分光光度引物（25pmol/µL）,BamHI限制性内切酶，XhoI限制性内切基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His标签蛋白纯化试剂盒，LB培养基，一次性针头滤器（孔径D.3序列合成及表达载体的构建D.4.1取A.3中的菌液，以1:100的00r/min震荡培养至菌液OD600值0.6～0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，诱导培养5h。/min离心10min，弃上清。D.4.4用15mLpH7.4PBS重悬沉淀，充分吹散混匀，将离心管置于碎冰中，再放到超声波细胞破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30D.4.7纯化后的蛋白溶液，用0.45µm一次性针头滤器过滤除菌。D.4.8用紫外可见分光光度计测定蛋白的浓度，蛋白浓度达到0.D.4.9用高效液相色谱法进一步纯化并分析蛋白纯度，纯度达到90%以上符合要求。Na2CO3NaHCO3200mL将Na2CO3和NaHCO3加入去离子水中，完全溶解后，用0.45µm一次性针头滤器过滤除菌，室温保