分子标记课件

分子标记技术原理与应用

ChapterV:MolecularMarkersandItsApplicationContents①引言(Introduction)②分子标记的原理

PrincipleofMolecularMarker③目前常用的分子标记技术

CommonlyusedMolecularMarkers④分子标记在园艺植物中的应用

ApplicationinHorticulturalcrops

标记？遗传标记（Geneticmarkers)：是能明确反映遗传多态性的生物特征。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。遗传标记geneticmarker

形态标记

色泽，形态…

细胞学标记

倒位，易位，G/N/C带…

生化标记同功酶…

分子标记

RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP…

…形态标记

Morphologicalmarker遗传学上稳定、可见的外部特征

特点：直观简单缺点：粗放，易受环境影响、数量有限概念：能明确反映遗传多态性的细胞学特征，染色体结构的数目是常见的细胞学标记，它能反映染色体结构的数目的遗传多态性（染色体缺失、重复、倒位、易位）Cytologicalmarker方法：染色体计数、染色体显带优点：较形态学标记稳定，可靠缺点：过程复杂、对材料和仪器要求严格Cytologicalmarker种类：可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但结构的生理性质不同的一类酶。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。蛋白质标记的优点：数量更丰富，直接反映了基因产物差异。蛋白质标记的缺点：对非结构基因无能为力；数量有限，有时受发育时期影响。Biochemical(Protein)MarkerMolecularmarker

分子标记概念：一切能揭示DNA多态性的技术手段；它是DNA水平上遗传多态性的直接反映。也叫DNA标记。WhatisDNA?Deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸遗传物质（HereditarySubstance）

①稳定的含有生物体的各种遗传信息

②能精确复制

③能够变异JamesDeweyWatsonFrancisHarryCrick特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。Molecularmarker现有数十种分子标记技术。万变不离其宗：分子杂交、PCR扩增第一类：分子杂交为核心代表：RFLP、DNA指纹第二类：PCR为核心代表：RAPD、SSR、AFLP第三类：其它新型标记如SNP

基于新一代测序技术Categories英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymor-PhicDNA随机扩增多态性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SNPSinglenucleotidepolymor-phism单核苷酸多态性植物遗传研究中几种主要的ＤＮＡ分子标记1980年以来，RFLP；1984年以来，SSR；1990年以来，RAPD；1993年以来，AFLPMethodsforDNAExtraction方法：SDS法和CTAB法。原理：在去污剂和适当温度条件下充分裂解细胞，并抑制DNA酶活性；经氯仿、苯酚等处理使蛋白质变性，离心后除去。溶液中的DNA经酒精或异丙醇沉淀。ApparatusforDNAAssayingAgaroseGelElectrophoresisDNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量——小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。试剂：电泳缓冲液（TAE或TBE）；电泳琼指糖；EB或SYBRGreen；指示剂（加样缓冲液）仪器：电泳仪（直流电）；电泳槽AgaroseGelElectrophoresis12345678910111213141516PolyacrylamideGelElectrophoresis

DNA片段的观察EB染色，紫外发光银染荧光同位素DNAVisualizationTechnique—SilverStaining

电泳后，在醋酸中固定测序胶除去电泳液和凝胶中的尿素，并防制小片段扩散。换几次水除去固定剂。胶在硝酸银和甲醛中染色。在染色后，将凝胶用水清洗，在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色。甲醛将与DNA结合的银离子还原为金属银。硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。在显色一定的时间后，用水清洗一下，在空气中干燥。DNASilverStainingFluorescenceStainingEB、SYBRGreen、DAPE等IsotopeLabeling

Molecularmarker—

Hybridizaton-basedmarks

RFLP的中英文全称RFLP的基本原理及优缺点RFLP的主要仪器及基本操作全称：RestrictionFragmentLengthPolymorphismbyBotstein(1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱RFLP（限制性片段长度多态性）PrincipleforRFLPsSameprincipleforDNA/DNA,DNA/RNA,orRNA/RNAProceduresforRFLPs高质量DNA提取DNA酶切、电泳、转膜、固定探针制备、标记预杂交、杂交洗膜、压片、显影膜再生ProceduresforRFLPs限制性酶切：取10—15微克DNA，加入约5U于最适温度下保温12—18小时。ProcessesforRFLPManipulation转膜探针标记杂交洗膜放射自显影ProcessesforRFLPManipulationExampleofRFLPinCitrusByChengetal,2003.(PublishedinPMBR)TypeofpminRFLPMarkersRFLP标记的优缺点优点：共显性，非常稳定，是目前公认的最可靠的标记方法缺点：数量少，多态性位点不够；DNA纯度要求高、用量大；检测步骤多、周期长；费时、费钱；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；同位素有放射性Molecularmarker—

PCR－basedmarkersPCR（聚合酶链式反应）全称：PolymerphaseChainReaction基本原理：是在试管中模拟细胞内的DNA复制注意两个完全不相关的概念：PCR与PCD（ProgrammedCellDeath）程序性细胞死亡1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……BriefonPCR1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年度诺贝尔化学奖BriefonPCRKaryMullis1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，专长有机合成。1975堪萨斯州医学院心脏科找到工作。不久他就感到厌恶，实验需要宰杀许多老鼠。1979年，穆里斯进了一家名叫“西特斯”（Cetus）的私人生物技术公司任职。1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。该年8月，穆里斯首次在公司里正式作了有关PCR原理的报告，听者反应冷淡。一来，大家已经习惯了他的胡思乱想；再者，多数人的想法是，这个原理太简单了，如果可行的话，一定早有人做过，否则，里头一定有它不可行之处，但也没有人明确说得出来，为什么不可行。1985年春天，西特斯的高级主管已经对PCR的潜力信服，穆里斯和三个技术员。第一篇提到PCR这个方法的论文，日裔技术员才木于1985年12月20日发表在《科学》周刊上，共有七位作者，才木排头名，穆里斯则排第四。1987，《酶学方法》（MethodsofEnzymology），主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟，较好沟通，同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是，穆里斯的文章终于得到发表，只不过整整晚了一年，到1987年初才问世。西特斯的主管向冷泉港实验室的沃森推荐穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学”专题研讨会中，报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，分子生物学界有头有脸的人也都在场。结果他表现不错，建立了往后人们的印象：PCR是穆里斯一手发明的。

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PrincipleforPCRTemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPrincipleforPCRPrimer:DNA合成时结合在模板上为合成提供3‘-OH的寡核苷酸片段1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PrincipleforPCR观看动画CurveofPCRReaction上样电泳成像PCR的实验过程PCR反应配置反应液PCRReactionSystem10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ulPrincipleforPrimerDesign(1)①引物长度：15-30b，常用为20b左右引物的有效长度不能大于38b，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500b为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对

特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处PrincipleforPrimerDesign(2)TaqDNAPolymerphaseTaqDNA聚合酶是从Thermusaquaticus菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94kDa。这种酶的天然形式可在74℃复制DNA，在95℃的半衰期为40分钟。TaqDNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿5'-3'方向发生聚合反应，形成双链DNA；同时它还具有5'-3'外切酶活性。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的.TaqDNAPolymerphase离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。TaqDNAPolymerphase抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20℃至少6个月。QualityandConcentrationofdNTPdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低Template（targetgene）对模板DNA质量的要求因标记的种类不同而有所差异，一般说来基于RFLP（酶切）的标记对DNA质量要求很高，而PCR标记对模板DNA质量要求并不很高，主要防止Taq酶抑制剂污染。ConcentrationofMg2+Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少OptimizationofPCRreactionPCR反应条件:温度时间循环次数Temperature&TimeSetting设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸PrimerAnnealingTemperatureTm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些ExtensionsTemperatureandtimeCycleNumbers循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多AdvantagesofPCR特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低FactorsEffectingPCRSpeciality引物与模板DNA特异正确的结合；TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性.最佳反应体系及扩增程序

HighSensitivityPCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平从100万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)在细菌学中最小检出率为3个细菌SimpleandquicklyPCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2-4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广

PCR-basedMarkersRAPD,SSR,andetc.PCRBasedMarker—RAPD发明：是Williams等人于1990年首创的一种DNA技术，被称为RandomamplificationofPolymorphicDNA(随机扩增的多态性DNA）原理：以PCR为基础,利用人工合成的约10b的随机序列寡核苷酸作引物,以生物的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。RAPD反应的循环次数可多达40—50次,每次循环中,双链DNA在95℃的高温下变性,解开双螺旋成为单链模板,然后在低温(36℃)条件下与随机引物结合,在DNA多聚酶的作用下，按碱基互补原则沿5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成DNA复制。如此反复数十次,可以使单一的DNA序列扩增105-107倍。PrincipleofRAPDRAPD操作PCR反应体系：

DNA（20ng/µl） 1µlPrimer 15ng10×Buffer 2.0µlMg2+（25mM） 1.2µlTaq酶（5U/µl） 0.15µldNTP（25mM） 0.2µl加水至20µl，再加入石腊油，进行PCR扩增。RAPDStep195℃2分钟Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循环Step672℃5分钟

PCR扩增程序：RAPDRAPDRAPD标记特征：①引物很短（10base）②只有1种引物参与反应③引物在染色体上随机结合④退火温度低一般为35-37℃⑤当两引物在互补的模板DNA链上的结合位点距离小于2000bp便可扩增出该区域。RAPD优点：--实验步骤少，省工、省力、进度快--不需先知道基因组的任何分子信息--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本--引物具有广泛性和通用性。缺点：

RAPD是一种显性标记,不能区分纯合子与杂合子；易受实验条件的影响,表现为扩增产物的稳定性差。RAPD标记RAPDSSR:

SimpleSequenceRepeat，简单重复序列，又称微卫星DNA（microsatellite）或短的串联重复（ShortTandemRepeat,STR)。微卫星DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。微卫星DNA广泛存在于真核生物中，人和动物（TG）n，植物（AT)n微卫星DNA长度的多态性;微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列。SSR标记微卫星DNA的类型单核苷酸重复(Mononucleotide)(A)11 AAAAAAAAAAA2、 二核苷酸重复(Dinucleotide)(GT)6 GTGTGTGTGTGT3、 三核苷酸重复(Trinucleotide)(CTG)4 CTGCTGCTGCTG4、 四核苷酸重复(Tetranucleotide)(ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。SSRTypesof

MicrosatellitesHomozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…

5’flankingregion microsatellitelocus 3’flankingregionHeterozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…SSR

根据两端序列的保守性设计引物进行PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性。PrincipleofSSR多态性好、重复好、共显性标记SSRWhereAreMicrosatellitesFound?Majorityarelocatedinnon-codingregionSSRSSRmarkerDevelopment基于DNA文库SSR基于生物信息学SSRmarkerDevelopment1102030405060708090100110SSRProceduresforSSRSSR操作与RAPD的主要不同之处在于：使用的是引物对，每条引物长度在18—25base之间。退火温度一般在50—60℃扩增循环数在25—35之间检测方式有琼脂糖胶或PAGE胶两种SSRSSRMarkerAppliedinCitrusSSR引物TAA1在柑橘属及其近缘属29个样品中的扩增带型SSRSSR标记的优点约50%呈多态性共显性数目多且在基因组中均匀分布多数位点呈选择中性，符合群体遗传学了理论技术上适合用PCR分析半自动化，结果可靠部分降解的DNA样品也可用适合于等位酶变异小的居群水平的研究SSRSSR标记的缺点可用的位点数目少设计引物的费用高，耗时长物种专一性在说明群体分化和物种分化时可能产生错误SSRRestrictionandPCRCombinedMarker—AFLPAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismBriefonAFLP荷兰Zabeau和Vos1992年发明结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。AFLPPrincipleofAFLP基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。AFLP①②③PrincipleofAFLPAFLPProceduresforAFLPAFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：

首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。

酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。

1.DNA片段的预扩增。

2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。

3.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。

4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析AFLPCharacterizationofAFLP--理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。--每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用--呈典型的孟德尔方式遗传--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。--可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段，—对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。AFLPAdaptorforAFLPAFLPPre-amplificationAFLPSelectiveAmplificationAFLPProceduresforAFLPAFLPProceduresforAFLPAFLPAFLP标记不需要基因组的信息重复性较高DNA需量少高多态性、高效率、高精确性可标记整个基因组AFLP优点：缺点：被认为是显性标记Molecularmarker—SNPSNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，因而它的数量非常丰富。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。目前已超过900万个，相关报道文献7000余篇。TypesofMolecularMarkersRFLP-restrictionfragmentlengthpolymorphism(pm)（限制性片段长度多态性）VNTR-variablenumbertandemrepeat（变化数目的串联重复）RAPD-randomamplificationofpolymorphicDNA（随机扩增的多态性DNA）AFLP-amplifiedfragmentlengthpm（扩增片段长度多态性）SSR-simplesequencerepeat（简单序列重复）ApplicationofMolecularMarkersApplications1.种质评价和核心种质筛选鉴别品种和品系；检测资源多态性；鉴定新种质；核心种质筛选2.杂种鉴定和早期辅助选择育种亲本选择；育种过程监测；早期分子辅助选择（markerassistedselection,MAS）3.构建遗传连锁图基因定位（QTL);比较基因组研究;基因克隆（图位克隆）4.生物起源和进化研究利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。以具有遗传多型性的分子标记为“路标”。植物基因组遗传作图/gdr目前，果树作物的做图发展迅速：在甜橙已发表的遗传图中，已有200多个标记。蔷薇科果树还专门建立了做图网站：/gdr.里面已搜集了苹果、梨、桃、杏、李、樱桃、树莓等果树的多个杂交组合的图谱。产量、品质、熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位（QuantitativeTraitLoci,QTLs）和环境因子的共同作用。数量遗传学无法确定控制数量性状的QTLs数目，也无法确定单个QTL的遗传效应及染色体位置。分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs定位的多种方法。数量性状基因的定位QTL作图所需的数据遗传标记数据数量性状数据

这是蔷薇属遗传图与抗白粉病性状的QTL定位（左一），中间和右边的连锁图分别是是李属（Lalli等，2005）和苹果属（Calenge等，2005）的连锁图与抗白粉病QTL定位。基于图谱的基因克隆

图位克隆条件：(1)目标基因附近紧密连锁的DNA标记；(2)知道这些标记与目的基因的位置一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。通过图位克隆得到的基因大都来源于模式植物，必须拥有高密度的分子图谱。对于果树作物来说，这条途径几乎不可行。比较基因组研究

利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。这种标记也叫可转移标记（portable/transferablemarker.)新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。eg番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；蔷薇科苹果属和梨属之间的共现性（Dirlewanger等，2004）启示：模式植物上遗传作图成果可推而广之。可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。应用比较基因组学进行基因的克隆对番茄和土豆比较基因组分析，使用高密度分子图谱，克隆得到了马铃薯一抗晚疫病基因。该研究2005年发表在权威杂志ThePlantJ.上，是比较基因组学在园艺植物的一个经典应用。研究基因表达与调控AFLP研究基因表达是非常有效的方法，可同时比较植物发育的不同时期以及分离某些重要基因（cDNA-AFLP）。

利用cDNA-AFLP的方法，孙涌栋等克隆得到了5个黄瓜果实膨大相关基因