GB∕T 43271-2023 木材鉴定 DNA条形码方法（正式版）

木材鉴定DNA条形码方法2023-11-27发布 I引言 Ⅱ 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂 6仪器与设备 37试验步骤 3 9鉴定报告 附录A(资料性)木材DNA条形码鉴定方法的常用条形码类型及通用引物 7附录B(资料性)木材DNA条形码的序列一致性分析 附录C(资料性)木材DNA条形码序列的邻接树构建 附录D(资料性)木材DNA条形码序列的最大似然树构建 参考文献 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家林业和草原局提出。本文件由全国木材标准化技术委员会(SAC/TC41)归口。本文件起草单位：中国林业科学研究院木材工业研究所、中国科学院植物研究所、安徽农业大学、中国中医科学院中药研究所、广西大学、中华人民共和国张家港海关、山东省产品质量检验研究院、云南濒科委司法鉴定中心、天津工业大学、中国检验认证集团天津有限公司、东阳市千百年红木家具有限公司、北京天怡利华沉香技术研究院、山东巧夺天工家具有限公司、浙江精典木材检测服务有限公司、浙江省木雕红木家具产品质量检验中心、山西紫檀臻品红木家具有限公司。Ⅱ易执法和国内市场监督管理的迫切需求。DNA条形码方法为木材“种”水平鉴定提供了技术依据。为促进木材合法贸易，增强《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)履约能力，提升我国木材产业链监管水平，进一步推动我国林业产业健康可持续发展，特制定本文件。1木材鉴定DNA条形码方法2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。来源于树木的次生木质部，主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成。生物体基因组中用于物种鉴定的一段标准的、相对较短的、易扩增的DNA(deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸)序列。具有相同的形态学、生理学特征和一定自然分布区的生物群，为分类学基本单位。亲缘关系相近的种的集合。木材标本xylariumwoodspecimens从树木主干或枝条部位采集的以木质部为主的包含完整树木分类学及采集信息的植物样本。刚伐倒后未经干燥的木材。2位于树干外侧靠近树皮部分的木材，一般含有生活细胞和储藏物质(如淀粉等)。边材树种是指心边材颜色无明显差别，木材通体颜色均一者。种是心材和边材区别明显的树种。在热能作用下以蒸发或沸腾方式排除木材水分的处理过程。聚合酶链式反应polymerasechainreaction;PCR用于扩增位于两段已知序列之间DNA的分子生物学技术。与特定DNA片段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，用于聚合酶链式反应。Phred质量分数Phredqualityscore评估测序反应准确性的质量指标，表示碱基信号错误概率。序列一致性sequenceidentity两条序列在同一位点核苷酸完全相同的部分所占的比例。分子系统发育树molecularphylogenetictree间系统发生关系的树状图。4原理DNA条形码方法是通过从未知样本(待检样本)中获取标准化DNA区域的核苷酸序列，然后使用生物信息学方法将该序列与参考数据库中的已知序列进行对比，最终根据对比结果将样本鉴定到物种水平。采用该方法的前提是条形码序列的种内差异要远小于种间差异，即存在条形码间隔。5试剂5.1所使用的水均应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。除另有规定外，所用试剂溶液宜大体积配制、小3体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。5.3十六烷基三甲基溴化铵[hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB,C₆H₃₃(CH₃)₃NBr]。5.4乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA,C₀H₁N₂O₈)。5.5三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,C₁HNO₃]。5.7聚乙烯吡咯烷酮[polyvinylpyrrolidone,PVP-40,(C₆H₉NO)₄o]。5.8二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT,C₄HoO₂S₂)。5.10三氯甲烷(chloroform,CHCl₃)。5.11异戊醇(isoamylalcohol,C₅H₁₂O)。5.12三氯甲烷：异戊醇(体积比24:1)。5.1470%乙醇(ethanol,C₂H;O)。5.15蛋白酶K(proteinase5.18氯化镁(magnesiumchloride,MgCl₂)。5.19脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP)。5.20琼脂糖(agarose)。5.21电泳缓冲液TAE[由三羟甲基氨基甲烷、乙酸(aceticacid,C₂H₄O₂)和乙二胺四乙酸组成]。6仪器与设备6.1超净工作台(平均风速0.25m/s～0.6m/s)。6.2低温冷冻研磨仪(液氮环境-196℃)。6.3超低温冰箱(一80℃)。6.4冰箱(-28℃~4℃)。6.5天平(精度为0.1mg)。6.6恒温水浴锅(工作范围30℃~70℃)。6.8低温高速离心机(可实现4℃离心，离心力9500g以上)。6.9分光光度计。6.11电泳仪。6.12凝胶成像系统。7试验步骤7.1.1应采用规范的实验室操作措施有效避免或消除外源污染及交叉污染。47.1.2试验前，将实验室进行紫外消毒。DNA提取和PCR扩增试验中，应按照操作步骤合理分隔试验区域，各区域的仪器和设备不应混用，试验操作需严格按照单一流向进行。试验后，应对与样品接触过的工作台、仪器与设备等进行消毒处理。7.1.3根据样品加工处理条件、保存状态、存储时间和取样部位的差异，通过优化DNA提取参数以提高DNA提取质量和效率。经干燥或长期存储的样品宜采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法，生材样品宜采用DNA提取试剂盒方法。7.1.4木材DNA提取和PCR扩增试验步骤中应设置阴性对照。7.2取样根据木材样品实际情况，宜选择生材、边材位置，避免腐朽等缺陷。取样质量一般应不小于2g(含水率为12%时)。样品首先采用3%次氯酸钠浸泡30min,然后切除样品外层表面(1mm～3mm)以去除外源污染，再利用低温冷冻研磨仪将样品研磨成木粉。一般来说，样品采集后尽快进行DNA条形码分析，否则宜储存在一80℃或液氮(一196℃)条件下。根据离心柱法或磁珠法DNA提取试剂盒说明书进行。7.3.2十六烷基三甲基溴化铵法操作步骤如下。a)细胞裂解：取约300mg木粉装入离心管中，分别加入3mL木材DNA裂解液[0.03g/mLCTAB,100mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,0.02g/mL~0.06g/mLPVP,5mol/LDTT],颠倒混匀；55℃水浴5h。b)抽提：水浴结束后，向离心管中加入等体积三氯甲烷：异戊醇(24:1),颠倒混匀5min;9000g、4℃离心10min;吸取上层水相于另一无菌离心管中。重复此操作1次。c)沉淀：向装有抽提后水相的离心管中加入等体积预冷的异丙醇(1/10体积3mol/L的乙酸钠和终浓度为0.02mg/mL～1mg/mL的糖原),上下颠倒混匀，此时可能出现白色絮状沉淀，在一20℃冰箱中放置30min。d)洗涤：9000g、4℃离心10min,倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，置于室温下晾干。e)溶解：向每管离心管中加入100μL无菌双蒸水溶解DNA。f)纯化：利用DNA模板纯化试剂盒进行木材DNA纯化。采用紫外分光光度法或荧光定量法等对木材DNA提取液进行浓度测定。7.5引物设计与PCR扩增7.5.1DNA条形码选择一般可选择rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、ycfl等叶绿体DNA片段和细胞核核糖体DNA内转录间隔区ITS作为通用DNA条形码。对于特定树种类群，也可使用针对该类群开发的专属DNA条形码。5引物序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列；引物长度一般为15bp～30bp;碱基尽可能随机分布，GC含量宜为40%～60%;引物内部应避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物序列的3’端应避免出现碱基A及3个以上的连续碱基。常用DNA条形码类型及通用引物实例见附录A。PCR操作流程如下。a)反应体系：反应体系的体积可选择20μL～50μL。当PCR反应体系为20μL时，各组分的终浓度如表1反应组分原浓度终浓度反应体积(20μL)ddH₂O10×PCR缓冲液MgCl₂25mmol/L2.5mmol/LDNTPs2.5mmol/L0.15mmol/L正向引物反向引物b)反应程序：反应程序通常可采用：94℃预变性为90s,94℃变性5s,Tm-5℃退火30s(T。为引物熔解温度),72℃延伸20s,循环40次，72℃终延伸5min,4℃保存待测。为提高扩增效率，可采用巢式PCR扩增。由于样本的异质性，应根据样本的实际情况调整反应体系和反应程序。PCR完成后，可将PCR产物临时存放于4℃冰箱，对于需长期保存的(一周以上)PCR产物应置于一20℃冰箱保存。琼脂糖凝胶电泳检测流程如下：a)称取适量的琼脂糖并加入电泳缓冲液中，配制成质量浓度1%～2%的溶液，加热溶解；b)冷却片刻，加入适量的核酸染料充分混匀，倒入放置好梳齿的胶槽中；c)待冷却凝固后，垂直向上拔去梳齿，将制胶板移至电泳槽中；d)取2μL～5μLPCR产物进行电泳，在凝胶成像系统下观察。7.6DNA测序与序列拼接PCR产物纯化后，以PCR扩增引物作为测序引物对DNA片段进行测序。6对测序结果进行质量评估，去除序列两端Phred质量分数小于20的碱基和测序引物序列，然后将正向和反向互补序列组装成一个完整序列。7.7DNA条形码序列分析7.7.1序列一致性将获得的DNA序列与参考数据库进行比对，通过两两序列局部比对或者搜索短的核苷酸字符串来查询数据库中最匹配的树种序列。参考数据库应已包含相关树种的序列。序列一致性分析实例见附7.7.2分子系统发育树将获得的DNA序列与参考数据库序列进行多重序列比对，根据优选的建树方法构建分子系统发育树，并用重复抽样检验方法评估分子系统发育树的可靠性。分子系统发育树构建实例见附录C和附当采用其他方法进行DNA序列分析时，应说明该方法的具体步骤。8判定采用序列一致性方法时，若满足序列最大一致性且唯一匹配条件，则判定为相应树种。采用分子系统发育树方法时，若聚类为独立分支，则判定为相应树种。当采用其他的序列分析方法时，应说明具体判定依据和判定结果。当DNA条形码序列分析无法判定相应树种，则应给出科、属等更高分类阶元的鉴定结果。9鉴定报告鉴定报告应包括木材样品照片、样品描述、试验方法、判定依据及鉴定结果等内容。7(资料性)木材DNA条形码鉴定方法的常用条形码类型及通用引物常用DNA条形码类型及通用引物见表A.1。表A.1木材DNA条形码鉴定方法的常用条形码类型及通用引物引物名称引物序列(5’-3’)适用范围rbcLrbcLbFAGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGTrbcLbRTCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCAmatKmatK472FCCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC被子植物(含阔叶树)matK1248RGCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGCGym_FlAATYGYRCTTTTATGTTTACARGC裸子植物(含针叶树)Gym_R1ATCAYCCGGARATTTTGGTTCGpsbA-trnHtrnHf_05CGCGCATGGTGGATTCACAATCCpsbA3fGTTATGCATGAACGTAATGCTCycf1bFTCTCGACGAAAATCAGATTGTTGTGAAT被子植物(含阔叶树)ycf1bRATACATGTCAAAGTGATGGAAAAycflgFTGAAAGCTCTAAGCAATGGATCYCC裸子植物(含针叶树)ycflgFATACGACCAATATTTTTRGCTATTATATGCGATACTTGGTGTGAATGACGCTTCTCCAGACTACAATCCTTATCAYTTAGAGGAAGGAGYGACTCTCGGCAACGGATAGCGTTCAAAGAYTCGATGRTTCRGTTTCTTTTCCTCCGCTTA8(资料性)木材DNA条形码的序列一致性分析以常用DNA数据库NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)为例。采用基于局部对比算法搜索工具(BLAST)的相似性搜索方法分析时，进入BLAST页面，将所获得的木材样品DNA条形码序列作为查询序列置于“输入查询序列(EnterQuerySequence)”窗口中；选择“选择搜索设置(ChooseSearchSet)"中“标准数据库(Standarddatabases)”,默认搜索范围为“核苷酸数据库(Nucleotidecollection)”;程序选择(ProgramSelection)中推荐优先选择“高度相似序列(Highlysimilarsequences)”;点击“BLAST”,获得最大一致性，确定匹配唯一性，完成序列一致性分析(见图B.1)。检索结果Description▼ScientificCommonNameNameTaxidMaxTn!aQueryEvaluePerAccLerce55ionPhgebezhennaoucherJY10smallsubunitriboscmalRNAgene.Rarlialsequence;inlemal…Phoebe…NA9431011097210972100%0.0100.0045941MT828602.1PhoebeboumeivoucherSCH08smallsubunitribosomalRNAgene,partialsequence;intem.…Phoebe…NA460784109641096499%0.099.98%5941MT628616.1 PhoebehuivoucherZF49smallsubunitribosomalRNAgene.partialsequence:intemaltrans…Ehoebe…NA 480785108591085999%0.099.66% MT628645.1 PhoabeaspZF55smallsubunitribosomalRNAgene.partialssquonce;internaltranscribads…Phoabe…NA27455541082910829100%0.[]99.56% MT628648.1PhaebeshearerivoucherWHQ1smallsubunitribosomalRNAgene.partialsaquencs;intema…Phoebe…NA 480789108131081399%0.099.56% MT828621.1PhoebeshearenivoucherZF45smallsubunitribosomalRNAgene,partialsequence;intemal…Phoebe…NA460789108111081199%0.009.56%5934MT628643.CinnamomumcaudiferumyoucherFD24smallsubunitribosomalRNAgene..partialsequenc.…Cinnam…NA2745578105381053899%0.098.71%MT628595.1CinnamomumparthenoxylonvoucherYBO4smallsutunitnbosomalRNAgone.partialseque…Cinnam…NA 714455105211052199%0.098.65%5835 MT628624.1CinnamomumcanphoravoucherKZ05smallsubunitribosomalRNAgene.gartialsequence;…Cinnam…carmpha…13429104531045399%0.098.47%592BMT628606.1图B.1基于木材DNA条形码的序列一致性分析示例9(资料性)木材DNA条形码序列的邻接树构建以分子进化遗传分析软件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,MEGA¹)中邻接法(Neigh- bor-joiningmethod)为例。采用基于邻接法的分子系统发育树方法分析时，进入M (File)”菜单中选择“打开文件(OpenaFile/Session)”,点击MEGA主窗口“系统发育(Phylogeny)”菜单选择“构建/测试邻接树(Construct/TestNe统发育测试(PhylogenyTest)”菜单中选择"自展法(Bootstrapmethod)",数值一般设置为1000;选择“模型/方法(Model/Method)”"替换类型(SubstitutionsType)""位点进化速率(RatesamongSites)"和“空位处理(Gaps/MissingDataTreatment)”关系，完成分子系统发育树构建(见图C.1)。P.zhonngn01P.zhorngn_02P,zhonngn_42P.zhonnan_4P.zharnan_P.zlierinan_P.zliernan_9:P.cheklangensis_01?ly;PghekiangetsisnPthekiargesis04PshcureniorPshcarwi_03Pshcargni_4Pshsaror_05Pshearer_KX437773一F.asisne:e_KX437772P.newanfh9_AH394255ieeH3942iiba'anseeKT₃he5!7pauhx_drhiepfspetde_q然Miepiphpt:Q7gicnisptpM:02ikfhunbcrgxikfhunbcrgx_6228|ikthunbergi_03ikthunbergx_04ikthunb6ngw_itt178404—Gnramomuncavghorg_6050970注：P-Phoebe楠属，M-Machilus润楠属。 图C.1基于木材DNA条形码的邻接树构建示例对这一产品认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。(资料性)木材DNA条形码序列的最大似然树构建以MEGA软件中最大似然法(MaximumLikelihoodmethod)为例。采用基于最大似然法的分子系统发育树方法分析时，进入MEGA界面，从“文件(File)”菜单中选择“打开文件(OpenaFile/Session)”,点击MEGA主窗口“系统发育(Phylogeny)”菜单选择"构建/测试最大似然树(Construct/TestMaximumLikelihoodTree)”,选择“数据类型(DataType)""选择遗传密码(SelectGeneticCode)”相应参数后进入“分析参数选择(AnalysisPreferences)”窗口，在“系统发育测试(PhylogenyTest)”菜单中选择"自展法(Bootstrapmethod)",数值一般设置为1000;选择“模型/方法(Model/分子系统发育树构建(见图D.1)。PrhennanfPzhervn_üg剖P.znsnngn_i剖P.zinsnngn_0cP.zhervar_rF.chgkiangansis_0lrchekianens:s_G2广9;F.chgkiangansis_03chekxgensts_04F.chgkianganss_05F.chariangensis_KY34651!PsneatarF.shsara_02F.shsaa_04P.steurer_0tlrsngsan_KX437773—P.bcurxKY346512—FomeensisKX437772F:xurwtheN1334?5dP.neuranfngaH394303P.nsuraning_wH394353 gignss