药物色谱分离技术-色谱分离操作过程（制药技术课件）

色谱分离技术--薄层色谱分离操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术大纲1.薄层色谱法概念2.薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术薄层色谱法（TLC）：将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

薄层色谱操作包括：制板、点样、展开、显色、Rf计算等。（一）薄层色谱法概念薄层色谱分离操作—色谱分离技术1.薄层板的制备

薄层板的薄层应尽可能的均匀而且厚度要固定。制备薄层板，首先将吸附剂调成糊状：如称取约3g硅胶G，加入到6-7mL0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成均匀的糊状物。这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。然后采用简单的平铺法和倾斜法将糊状物涂布在干净的载玻片上，制成薄层板。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术一般情况薄层越薄分离效果越好。铺板的方法有两种：(1)平铺法：如图所示，将自制涂布器洗净，把干净的载玻片在涂布器中摆好，上下两边各夹一块比载玻片厚0.25mm的玻璃板，在涂布器槽中倒入糊状物，将徐布器自左向右推，即可将糊状物均匀地涂在玻璃板上。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术(2)倾斜法

如没有涂布器，则可将调好的糊状物倒在载玻片上，用药匙摊开后，用手摇晃并轻轻敲击玻板背面，使其糊状物均匀铺开且表面均匀光滑。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术涂好的薄层板室温水平放置晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105-110℃活化30min。氧化铝板在200-220℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄板。150-160℃烘4h可得活性Ⅲ-Ⅳ级的薄板。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术

薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。注意硅胶板活化时温度不能过高，否则硅醇基会相互脱水而失活。活化后的薄层应放在干燥器内保存。（二）薄层色谱分离操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术2.点样点样所用工具如图所示。先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为基线，然后将样品溶于低沸点溶剂配成的溶液，用毛细管点样。在薄层色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。（二）薄层色谱操作操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术2.点样

样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多，往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，样点直径一般以2-4mm为宜。同一薄层上的样点直径应一致。另外点样要轻，不可刺破薄层。（二）薄层色谱操作操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术3.展开

将薄层板放入适宜的展开缸内展开。展开剂液面不要超过薄层板的基线。薄层板的展开需要在密闭的色谱缸(也可用标本缸或广口瓶等)中进行，如图所示。用来展开样品中各组分的溶剂(流动相)称为展开剂。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术3.展开

先将一定量展开剂放在色谱缸中，盖上缸盖，让缸内溶剂蒸气饱和5-10min。再将点好试样的薄层板样点一端朝下放入缸内(注意控制器皿中展开剂的量，切勿使样点浸入展开剂中），盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分离。当展开剂前沿上升到样点上方8-10cm时取出薄层板，放平，铅笔标明溶剂前沿位置，冷风吹干溶剂。计算比移值。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术化合物在薄板上移动距离的多少取决于所选取的溶剂不同。但凡溶剂的极性越大，对化合物的洗脱能力也越大，即Rf值也越大。一个好的溶剂体系应该使混合物中所有的化合物都离开基线，但并不使所有化合物都到达溶剂前端，Rf值最好在0.15～0.85之间。最理想的Rf值为0.4-0.5。（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才能确定。

一些常用溶剂和它们的相对极性：（二）薄层色谱操作薄层色谱分离操作—色谱分离技术4.显色展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时，可直接观察。若化合物本身无色，可在紫外灯下观察荧光斑点，也可用显色剂显色。简单常用的显色剂是碘蒸气，广口瓶中放置少量碘晶体，使用时将薄层板放入，盖上瓶盖，密封瓶内的碘蒸气即可使大部分有机化合物显色(饱和烃与卤代烃除外)。（二）薄层色谱操作色谱分离技术--薄层色谱原理及特点薄层色谱原理及特点—色谱分离技术大纲1.薄层色谱原理2.薄层色谱特点薄层色谱原理及特点—色谱分离技术薄层色谱(简称TLC)，属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。适用于小量样品的分离。薄层色谱是一种非常有用的跟踪反应的手段，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

常用作柱色谱的先导，可用于柱色谱分离中展开剂的选择，可监视柱色谱分离状况和效果。（一）薄层色谱原理薄层色谱原理及特点—色谱分离技术最常用的薄层色谱属于液-固吸附色谱，把吸附剂(如氧化铝、硅胶)和粘合剂(如煅石膏、羧甲基纤维素钠等)均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，将分离样品滴加在薄层的一端，当利用毛细作用使流动相沿着吸附剂薄层(固定相)移动时，吸附剂借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分，各组分以不同的作用强度被吸附。（一）薄层色谱原理薄层色谱原理及特点—色谱分离技术

被分离组分在固定相与流动相之间进行分配或吸附，经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡，不同组分的极性化合物就会在薄层板上移动不同的距离。极性强的化合物会“粘”在极性的吸附剂上，在薄板上移动的距离比较短。而非极性的物质在薄层板上移动较大的距离。（一）薄层色谱原理薄层色谱原理及特点—色谱分离技术

化合物移动的距离大小用比移值（Rf值）表达，是介于0

1之间的数值。

比移值的定义为：组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比。

即：样品原点到斑点中心的距离与样品原点到溶剂前沿的距离之比。如图所示。（一）薄层色谱原理薄层色谱原理及特点—色谱分离技术

薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。

薄层色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂；

硅胶G含煅石膏做粘合剂；

硅胶HF-254含荧光物质，可在波长254nm紫外光下观察荧光；

硅胶GF-254含有煅石膏和荧光剂。

薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。（一）薄层色谱原理薄层色谱原理及特点—色谱分离技术薄层色谱是纸色谱和柱色谱的结合，兼具二者的特点。①设备简单，操作方便。只需一块玻璃板和一个层析缸，即可进行复杂混合物的定性与定量分析及分离制备。其原理与经典柱色谱相同，但在敞开的薄层上操作，在检查混合物的成分是否分开以及在显色时都比较方便。（二）薄层色谱特点薄层色谱原理及特点—色谱分离技术②快速，展开时间短。薄层板比滤纸的毛细管作用大，因此展开速度快，薄层色谱一般只需十几分钟至几十分钟。③显色方法选择范围宽。如对于无机物固定相，可采用腐蚀性的显色剂。（二）薄层色谱特点薄层色谱原理及特点—色谱分离技术

④可以选用各种固定相。移动相也可广泛选用，比纸色谱有显著的灵活性。

⑤斑点比较密集，检出灵敏度较高。

⑥可适用于大型制备色谱。如增加薄层厚度，可增大样品的处理量。（二）薄层色谱特点薄层色谱原理及特点—色谱分离技术

⑦展开机理和方式多种多样。

⑧可适用于热不稳定、难挥发药物的分离，但不适用于挥发性药物的分离。另外，对于成分太复杂的混合物，用薄层色谱法分离还是有困难的。（二）薄层色谱特点色谱分离技术--亲和色谱的分离操作亲和色谱的分离操作—色谱分离技术大纲1.操作条件的选择2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术吸附条件的选择

吸附反应条件最好是自然状态下，配体与目的分子之间反应的最佳条件；

注意控制流速，不能太快；

吸附时间的控制，延长时间可促进吸附；

进样量的大小控制，减少进样量，可提高吸附效果。1.操作条件的选择亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（2）清洗条件的选择。洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附条件与目的分子洗脱条件之间。（3）洗脱条件的选择。在实际操作过程中，应该在洗脱强度和耐受程度之间做好平衡。1.操作条件的选择亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（1）样品制备。一般地说，杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术亲和色谱样品预处理的主要程序：①颗粒、细胞碎片、膜片段等的去除；②样品的浓缩及除去蛋白酶或抑制剂。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（2）配基与目的物结合条件的选择

配基与目的物的特异性结合需要适宜的pH、缓冲液盐浓度和离子强度。pH不仅能调节配基的电荷基团，也能调节目的物的电荷基团。中等盐浓度的缓冲液，能稳定溶液中蛋白质，并防止由于离子交换所引起的非特异性相互作用。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（3）柱操作

柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯化的蛋白质的量。一般地说，高的容量可以用于粗的短柱，大多数情况下，可以采用一次性的塑料小柱和1～5mL凝胶。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（4）流速的控制

提高流速可提高分离速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在适当的流动下进行，既要保证高速度，又要保证高效率。为了使纯化蛋白能够得到好的洗脱峰、最小的稀释度和最大的回收率，最好使用低流速。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（5）清洗清洗过度会使目标产物的损失增多，而清洗不充分则使洗脱回收的目标产物纯度降低。

具体操作是：样品吸附在柱上之后，必须用几倍体积的起始缓冲液对柱清洗以除去不结合的所有物质。2.操作方法亲和色谱的分离操作—色谱分离技术（7）柱的再生具体操作是用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未知的杂质往往仍结合在柱上，必须用苛刻的条件才能除去。应根据载体材料的不同、配基的性质以及它与载体连接方式的不同，酌情处理。2.操作方法色谱分离技术--亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备—色谱分离技术大纲1.载体的选择2.配基的选择3.载体的活化与偶联4.影响吸附剂亲和力的因素亲和吸附剂的制备—色谱分离技术

亲和色谱是应用生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上，制得亲和吸附系统。生物分子上具有特定构象的结构域与配体的相应区域结合，具有高度的特异性和亲和力。亲和吸附剂的制备—色谱分离技术①载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。②具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。1.载体的选择亲和吸附剂的制备—色谱分离技术③具有高度的水不溶性和亲水性。④具有稀松的网状结构，使大分子能自由进入⑤载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。1.载体的选择亲和吸附剂的制备—色谱分离技术常用的亲和色谱载体主要有：多孔玻璃载体；聚丙稀酰胺载体；纤维素载体；葡聚糖凝胶载体；琼脂糖凝胶；交联琼脂糖凝胶载体等。1.载体的选择亲和吸附剂的制备—色谱分离技术根据配基应用和性质，可将其分为两类：特殊配基和通用配基。亲和层析中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、某一酶的专用抑制剂、某一激素的受体等。通用配基可适用于一类物质的分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基。2.配基的选择亲和吸附剂的制备—色谱分离技术配基选择时应注意，所选配基应只能识别被纯化的目的物(配体)；

配体与配基应该有足够大的亲和力；

配基与相应目的物之间的结合应具有可逆性；

配体具有足够的稳定性，能够耐受反应条件以及清洗合再生等。另外，配基的分子大小必须合适。2.配基的选择亲和层析纯化蛋白亲和吸附剂的制备—色谱分离技术载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基连接，偶联前一般需先活化，载体表面经过活化后，产生的活性基团可以在简单的化学条件下，与配基上的氨基、羧基、羟基和醛基等功能基团，发生共价结合反应，这一过程称为配基的键合。

载体表面的基团必须具有通用性和高效性，可以与上述配基上的常见基团发生简单、快速的反应。3.载体的活化与偶联亲和吸附剂的制备—色谱分离技术①配基浓度对于亲和力低的系统，为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。②空间障碍在制备有些吸附剂时需要在载体与配基之间插入一段适当长度的多烃链“手臂”，以增加与载体相连的配基的活动度并减轻载体的立体障碍。4.影响吸附剂亲和力的因素亲和吸附剂的制备—色谱分离技术③配基与载体的结合位点在多肽或蛋白质等大分子作配基时，必须使它以最少的键与载体连接。④载体孔径载体孔隙是配体向配基接近的运动通道，所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响。4.影响吸附剂亲和力的因素色谱分离技术--纸色谱纸色谱—色谱分离技术大纲1.纸色谱概念2.纸色谱操作纸色谱—色谱分离技术纸色谱是以滤纸为载体的分配色谱。

滤纸纤维一般能吸附25%～29%的水分，其中6%～7%的水分以氢键与纤维素结合。

纸色谱的固定相即为滤纸纤维及其结合水；

流动相则为有机溶剂；

依据混合物中各组分在水相和有机相中的溶解度（分配系数）的不同，而实现各组分的分离。（一）纸色谱概念纸色谱示意图纸色谱—色谱分离技术（1）点样

将混合液（或溶于适当溶剂的混合物）用玻璃毛细管或点样器在滤纸上点样。要求点样点距纸底边约2cm，每点间距约2cm，点的直径一般小于0.5cm，也可点成3～5mm横长条。（二）纸