食品安全的快速检测-食品微生物快速检测

阪崎肠杆菌荧光PCR检测阪崎肠杆菌的介绍一荧光PCR检测技术的介绍二阪崎肠杆菌荧光PCR检测三目录介绍阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌是寄生在人和动物肠道内的革兰氏阴性菌，属肠杆菌科肠杆菌属，周生鞭毛，能运动，以前一直被称为“阴沟肠杆菌”。基于它与阴沟肠杆菌在生化反应、色素产物和抗菌灵敏度上存在差异，所以于1980年更名为阪崎肠杆菌。

阪崎肠杆菌可导致婴儿及早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，死亡率高达50％，已引起世界多国相关部门的重视。国家食源性疾病监测网自2007年起把阪崎肠杆菌列为婴儿配方食品重点监测病原菌。

介绍阪崎肠杆菌

阪崎肠杆菌具有产生a-葡萄糖苷酶和吐温80脂酶、不发酵三梨醇以及无磷酸胺酶活性等生理生化特征，并且对干燥、渗透压和抗生素等有很强的抗性。该菌自然来源非常广泛，在水、土壤、植物根茎、动物肠道甚至加工食品中都可存在。

介绍PCR检测技术基于a-葡萄糖苷酶反应的特异性生化检测和PCR扩增的分子检测技术已取得重要进展，但是目前还缺乏一种稳定检测该菌的分子分型检测技术。近年来，被公认为诊断标准的新型实时定量PCR扩增荧光检测技术和仪器实时荧光定量PCR仪可以实现阪崎肠杆菌的分子分型定量检测。PCR检测法的分类及优点PCR检测技术荧光法电泳法ELISA法灵敏度高特异性强抗污染能力强容易操作PCR技术的发展荧光PCR法PCR的发展可分为3阶段：定性PCR（电泳法）酶免法定量PCR实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术的优点荧光PCR法重复性、稳定性好浓度梯度试验线性范围宽热循环热降温快速荧光定量在对数期进行定量分析标本取样阪崎肠杆菌荧光PCR检测法取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。按照“三管”增菌法，无菌称取100g、10g和1g样品各三份分别加入2L、250mL、125mL的样品稀释瓶中，加入9倍预热到45℃的灭菌水（1:10稀释），或者将样品直接称量到装有9倍预热的45℃灭菌水的样品稀释瓶中振荡使样品充分混匀，36℃±1℃培养18~22h分别移取培养18~22h的悬液各10mL加入90mL肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）中，36℃±1℃培养18~22h检测步骤（1）试剂制备取出反应管N支（N=样本数＋1管阳性对照＋1管阴性对照），快速离心后，存于4℃备用。（2）DNA提取标本处理：每瓶培养的EE肉汤分别取1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸取去除上清液；加入50μLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴10min,12000r/min离心5min，取上清液2μL做模板进行PCR反应。（3）PCR扩增取出备用的PCR反应管，分别加入处理后的样品上清2μL，阴阳性对照直接加2μL,瞬时离心后放人仪器样品槽进行PCR反应。食品快速检测技术分类试验有效性判定设定阈值线高于阴性对照最高点，阳性对照的Ct值≤25.0，反应有效。食品快速检测技术分类结果判定食品快速检测技术分类设定阈值线高于阴性对照最高点，检验样本Ct值小于或等于25.0时，报告阪崎肠杆菌筛选阳性；检验样本Ct值大于25.0且小于30.0时，重复一次，如果Ct值仍小于30.0,且曲线有明显的对数增长期，可报告阪崎肠杆菌筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌未检出；样本检验不到Ct值，或Ct值为0时，报告阪崎肠杆菌未检出。金黄色葡萄球菌的快速检测金黄色葡萄球菌介绍一金黄色葡萄球菌检测方法二金黄色葡萄球菌的快速检测三目录介绍金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。

介绍金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌能产生多种致病性物质，如肠毒素及凝固酶等。金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是一个全球性公共卫生问题，据美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，居第2位，占细菌性食物中毒的33％，加拿大的发生率更高，占细菌性食物中毒的45％。限量标准金黄色葡萄球菌

我国每年发生的此类中毒事件也非常多，国家卫生和计划生育委员会于2013年发布《食品安全国家标准食品中致病菌限量》(GB29921-2013)，在国标中制定了金黄色葡萄球菌的限量标准，规定熟肉制品、熟制水产品、熟制粮食制品等8大类食品中，同批次采集5份样品，每份样品中的金黄色葡萄球菌浓度均不得超出1000CFU/g，仅允许其中1份样品在100~1000CFU/g之间。检测方法金黄色葡萄球菌检测方法目前，金葡菌的检测方法主要有传统生化鉴定方法、免疫学、分子生物学快速检测方法等。传统生化鉴定方法操作简单，稳定性强，成本低，是目前最常用的鉴定方法。方法金黄色葡萄球菌检测方法免疫学检测方法主要是基于免疫学理论研究，其是通过设计的抗原、抗体和免疫细胞，检测抗原和抗体的结合以及免疫细胞分泌的细胞因子的，从而达到检测目的一种实验方法。该技术方法主要包括酶联免疫法、免疫荧光法、免疫胶体金法等

方法金黄色葡萄球菌检测方法方法金黄色葡萄球菌检测方法分子生物学检测方法主要包括聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，核酸探针技术，环介导等温扩增技术等技术。方法金黄色葡萄球菌检测方法试剂盒法：试剂盒法通常将十多种，甚至几十种培养基或成分集中在特定微型装置内，通过观察微生物的生长和代谢过程的某些产物或现象，对试验现象进行分析，将传统试验中多次试验通过一次完成，缩短了检测时间。此法可大大缩短测试时间，在24h内得出结果，甚至某些可缩短至4h内。目前，用于检测金黄色葡萄球菌的成品试剂盒有API、MIS等

测试片的原理金黄色葡萄球菌测试片本试验利用金黄色葡萄球菌自身生化特性优化培养基，通过代谢而产生特异性酶或其他特异性物质，在培养基中添加相应的显色底物，使菌落呈现特定的颜色实现分离和鉴别。通过无纺布、冷凝胶、塑料薄膜等作为培养基的载体，将以上材料组装成金黄色葡萄球菌的测试片，缩短了检测时间、降低了劳动强度、节约成本。检测原理金黄色葡萄球菌测试片金黄色葡萄球菌测试片（FilmplateTMStaphylococcusaureusBT206)含有选择性培养基和专一性的酶显色剂，运用微生物测试片专有技术，做成一次性快速检验产品，一步培养15~24h就可确认是否有病原菌的存在，大大地简化了检测程序。金黄色葡萄球菌测试片适用范围金黄色葡萄球菌的快速检测本产品适用于各类生、熟食制品，饮料，糕点类，调味品，乳制品等的快速检测。样品处理金黄色葡萄球菌的快速检测取样品25mL(g)放入含有225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，调节样品匀液pH至6.0~8.0。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，每次换一支吸管。接种一般食品选2~3个稀释度进行检测，将金黄色葡萄球菌测试片（BT206)置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右，使培养基凝固，每个稀释度接种两片。做一片空白阴性对照。金黄色葡萄球菌的快速检测培养将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃,培养15~24h。金黄色葡萄球菌的快速检测培养后测试片现象测试片上紫红色的菌落为金黄色葡萄球菌；呈蓝色的菌落为其他大肠菌群。

出现阳性菌落的样本，最好用其他更为可靠的方法进行验证，没有条件的至少要再取样重复检验一次。金黄色葡萄球菌的快速检测结果判读（1）选择菌落数在20~200个之间的纸片进行计数。（2）若两个稀释度的菌落数均在20~200之间，则取其平均菌落数乘以稀释倍数，即为每毫升（或每克）样品中金黄色葡萄球菌数。（3）如果所有稀释度的测试片上的菌落数都小于20,则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。金黄色葡萄球菌的快速检测结果判读

（4）如果所有稀释度的菌落数都大于200，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。计数菌落数大于200的测试片时，也可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20(滤纸区面积为20cm2)，即为测试片上估算的菌落数。报告单位以CFU/mL(或CFU/g)表示。金黄色葡萄球菌的快速检测优点省去了配制培养基、分装灭菌等前处理和试验后清洗玻璃器皿等一系列繁杂的准备和整理工作，能大幅度减少工作量；携带方便，检测成本较低；操作简便迅速，对操作人员和检验设备及场所的要求也不高，可在基层检验机构或食品生产企业进行推广应用。金黄色葡萄球菌的快速检测沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）检测背景01实验方法及原理02样品处理与测定步骤03应用范围及结果分析04检测背景检测背景沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。：）沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）@_@实验方法及原理实验方法及原理酶联免疫吸附法01该技术具有特异性强、敏感性高等优点，可以在短时间内准确地将有害微生物检测出来。沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）实验方法及原理实验试剂02固相的抗原或抗体1酶标抗体或抗原2显色剂3沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）实验方法及原理实验原理03@_@沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）样品处理与测定步骤样品处理与测定步骤样品处理01待测样品匀液的制备与稀释:)沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）样品处理与测定步骤测定步骤02加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1mL,37℃孵育0.5～1h,洗涤。2:)加一定稀释的待测样品0.1mL于已包被异性抗体反应孔中，置37℃孵育1h，然后洗涤，同时做空白孔、阴性对照及阳性对照孔。1:)加底物液显色于各反应孔中，加入临时配制的底物溶液0.1mL,37℃孵育10～30min。3:)沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）样品处理与测定步骤测定步骤02结果测定置于酶标仪上测定各孔的OD值，并记录结果，读数在加终止液10min内完成。5:)终止反应于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。4:)沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）样品处理与测定步骤测定步骤02@_@沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）适用范围及结果分析适用范围及结果分析应用范围01所有食品原料中的沙门氏菌检测:)沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）适用范围及结果分析结果分析02临界值(CO，cutoff)的计算:临界值=阴性对照孔OD均值×2.1。1:)沙门氏菌的快速检测（酶联免疫吸附法）阴性对照孔OD(opticaldensity)均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计