（高清版）GBT 41692-2022 化学品 稀有鮈鲫幼体生长试验

CCSA80化学品稀有鮑鲫幼体生长试验2022-10-12发布2022-10-12实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：上海市检测中心、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、中国科学院水生生物研究所、中国检验检疫科学研究院、厦门市格灵生物技术有限公司、生态环境部南京环境科学研究所、沈阳化工研究院有限公司、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、广东全庆检测有限公司。1化学品稀有鮑鲫幼体生长试验1范围本文件规定了化学品稀有鲍鲫幼体生长试验的受试物所需信息、方法原理、仪器设备、试验系统、试本文件适用于评价化学品对稀有鲍鲫幼体生长的影响。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T21806化学品鱼类幼体生长试验3术语和定义GB/T21806界定的术语和定义适用干本文件4受试物所需信息受试物所需信息包括：a)水中溶解度；b)蒸气压；c)结构式；d)纯度；e)在水中和光照条件下的稳定性；f)水解离常数(pKa);g)水溶液中的定量分析方法；h)正辛醇-水的分配系数(Pow);i)急性毒性试验结果；j)快速生物降解试验结果5方法原理将处于指数生长阶段的稀有鲍鲫幼体作为试验鱼称重后放入试验容器中，并在受试物的亚致死浓度范围内暴露于流水式试验条件或半静态试验条件。试验周期为28d。每天投饵，投饵量根据试验鱼的初始质量计算，14d后允许重新计算投饵量。试验结束时，试验鱼再次称重，通过回归模型来估计引起百分之x(x%)生长率变化的浓度EC₂,例如EC₀、EC₂0或EC30,分析对其生长率的影响。另外，也可通过与对照组的比较确定最低可观察效应浓度(LOEC)和无可观察效应浓度(NOEC)。26仪器设备仪器设备包括：a)溶解氧测定仪(1%);b)水硬度计(1mg/L);c)温度控制系统(0.1℃);e)分析天平(0.0001g);f)惰性材料'制成的试验容器，规格一致，其容积宜适用于承载量和饲养密度，且应符合附录A的规定；g)适用于流水式的连续分配和稀释系统(如计量泵、稀释仪等)。7试验系统7.1试验方式的选择在试验之前，应根据受试物在水中的溶解度和化学稳定性确定合适的试验方式(流水式试验系统或半静态试验系统),然后选定需用的容器和装置?’。7.2稀有鮑鲫试验鱼种为稀有鲍鲫(Gobiocyprisrarus),鱼龄范围为1月龄～3月龄，体重范围为0.050g~0.100g。应在养鱼场和实验室条件(pH值为6.5～8.5;温度为21℃~25℃;光照为每天12h～16h;溶解氧浓度不低于空气饱和值的80%)下驯化和饲养。试验幼鱼应从单一驯化群中随机挑选。7.2.2.1稀有鲍鲫幼鱼用于试验之前，应在与试验相同的条件下至少驯养14d。暂养条件可与驯养条件一致。暂养、驯养和试验期间，最小投饵量每天不应低于体重的2%,宜为体重的4%。7.2.2.2驯养开始48h后，记录死亡率，并按下列条件处理：a)7d内死亡率小于5%,可用于试验；b)7d内死亡率在5%～10%之间，继续驯养7d,如果死亡率大于5%,舍弃整组试验鱼；c)7d内死亡率大于10%,舍弃整组试验鱼。7.2.2.3试验开始前的两周内或试验期间不应对鱼进行任何疾病处理。7.3试验用水任何宜于稀有鲍鲫长期存活和生长的水均可作为试验用水(例如活性炭除氯水等),且试验期间水质应维持恒定。试验用水的pH值为6.5～8.5,在试验期间变化幅度应保持在±0.5的范围之内。硬度(以CaCO₃计)范围宜为140mg/L～250mg/L。为避免试验用水对试验结果造成不良影响，应定期取2)根据试验方式和承载量进行选择。3Na+、K+、Cl-、SO₁²-等)、农药(例如总有机磷、总有机氯农药等)、总有机碳和总颗粒物。如试验用水水质相对稳定，可每3个月测定一次。如证明水质可维持稳定至少一年，则可延长分析时间间隔(例如每6个月一次)。合格试验用水应符合附录B的规定。7.4受试物的制备7.4.1通过稀释贮备液的方法来配制所需浓度的试验溶液。贮备液的配制宜采用机械方式(如搅拌或超声)使受试物在试验用水中简单地混合或搅动。可采用饱和溶液(饱和溶解度)获得合适的贮备液。当需要使用助溶剂或分散剂时，相应的溶剂对照组不应对幼鱼生长有明显影响，也不应对幼鱼有任何可观察的不利影响。通常宜使用的助溶剂为：丙酮、乙醇使用的分散剂为：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐温80、0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化氢化蓖麻油。在流水式试验系统中，使用易快速生物降解的溶剂和/或高挥发性化合物(例如丙酮)时应注意，避免这些物质导致细菌增多而产生问题。7.4.2流水式试验系统应具备连续分配和稀释受试物贮备液的系统(例如计量泵、稀释仪、混合系统)。试验期间，每天定时检查贮备液和试验用水的流速。7.4.3半静态试验系统中，试验溶液的更新频率取决于受试物的稳定性。受试物浓度不稳定(如超过配制浓度的±20%或低于初始实测浓度的80%),应采用流水式试验系统。8试验程序8.1试验设计8.1.1回归分析设计试验设计原则如下。a)试验设计的浓度应包含效应浓度(例如EC₀、EC₂0、EC3o),预试验有助于确定合适的试验浓度。b)试验应至少包括1个空白对照组以及5个不同浓度的试验组。如果试验中使用了溶剂，应增设1个溶剂对照组，所有试验容器中(除空白对照组)的溶剂浓度都应相同，且终浓度应不超过c)可采用几何级数系列或对数系列，见附录C,宜对数间隔。d)如试验容器超过6个，则超出的试验容器可设置为平行，或缩小浓度间距在原浓度范围内重新分配浓度。e)多数情况下，优先使用回归分析。当没有合适的回归模型(r²<0.9)时，可使用NOEC或LOEC。8.1.2方差分析估计NOEC/LOEC值的设计试验设计原则如下。a)每个浓度设置平行，对试验组(容器之间)进行统计分析。如没有平行组，则不必对容器之间的差异进行统计分析，对处于相同条件下的各试验鱼进行统计分析。b)至少设置5个浓度组，以几何级数分布，浓度间隔系数不超过3.2。c)如试验设置了平行，则对照组平行数量应为每个试验浓度组数量的两倍。如没有设置平行，则对照组鱼的数量应与每个试验浓度组数量相同，且每个试验组至少使用10尾鱼。d)如根据容器之间而非各试验鱼之间进行方差分析(ANOVA),需要足够的平行组，标准差自由度应至少为5。48.2试验准备8.2.1试验前对试验鱼称量，减少各试验鱼之间体重的差异。试验用稀有鲍鲫幼鱼的大小范围应符合附录A的规定。在试验开始时，所有试验鱼的个体质量应在平均体重的±10%内，任何情况下都不应超过25%。试验前可称取部分试验鱼估计平均体重。8.2.2试验开始前24h停止喂食，随机挑选试验鱼。使用常规麻醉剂[例如100mg/L三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐(MS222)水溶液，即由碳酸氢钠与MS222(质量比为2:1)中和而成]麻醉，逐尾称湿重(吸干水分)并符合附录A中规定的精度要求。保留体重在预期范围内的幼鱼，在各试验容器间随机分配。记录每个试验容器中鱼的总湿重。对幼鱼的处理应尽量小心以避免对试验动物产生胁迫与损伤。8.2.3试验28d后对试验鱼再次称重。如需重新计算饵料投喂量，在试验14d进行称重。8.3暴露条件8.3.1持续时间：应大于或等于28d,且不超过受试鱼指数生长期。8.3.2承载量和饲养密度：应符合附录A的规定。任何情况，承载量在没有曝气条件下溶解氧浓度不小于60%的空气饱和值。流水条件下，试验期间水质更新频率宜为6L/(g·d);更新条件下，水质更新频率根据化学品在试验用水中的稳定性而定。8.3.3喂食：投喂合适的饵料，应符合附录A的规定。通常每天喂食量宜为试验鱼初始总体体重的4%。如在14d再次称重，则重新计算喂食量。可将一天的喂食量均分为两份投喂，其间隔至少5h。称重前24h内不投喂。每天用吸管清除试验容器底部的饵料残渣和排泄物。8.3.4光照周期与水温应符合附录A的规定。8.4试验浓度8.4.1通常设置5个受试物浓度。如试验浓度低于5个应说明理由。设置的最高浓度不应超过受试物在水中的溶解度。8.4.2参考OECDNo.23选择合适的溶剂进行难溶受试物处理。如贮备液使用了溶剂，其最终浓度应不超过0.1mL/L或100mg/L。所有试验容器中(除空白对照组)的溶剂浓度都相同，并尽量避免使用溶剂。8.4.3空白对照组的数量依据试验设计而定。如使用了溶剂，溶剂对照组的数量应与试验用水对照组相同。8.5试验操作8.5.1.2流水式试验系统，每天检测试验用水与受试物贮备液的流速，试验期间的流速变动不应超过10%。如受试物浓度维持在配制浓度的±20%内，测定最高和最低浓度组的浓度。如受试物浓度超出配制浓度的士20%,至少在试验开始时及其后每周1次，测定所有浓度组的浓度。8.5.1.3半静态试验系统，如受试物浓度维持在配制浓度的±20%内，测定最高和最低浓度组新鲜配制的试验溶液和被更换的试验溶液。如受试物浓度超出配制浓度的±20%,至少在试验开始时及其后每周1次，测定所有浓度组的浓度。8.5.1.4通常宜以实测浓度表示试验结果。如试验期间受试物浓度维持在配制浓度或初始实测浓度的士20%内，结果可用配制浓度或初始实测浓度表示。5GB/T41692—20228.5.1.5对水样进行过滤(例如0.45μm微孔滤膜)或离心，优先采用离心方式。8.5.1.6试验期间，测定所有试验容器中的溶解氧、pH值和水温；同时还应测定对照组和1个最高浓度组中的总硬度。试验期间应至少测定3次溶解氧，即试验开始时、试验中期和试验结束时。半静态试验系统中，应增加溶解氧测定频率，最好在试验开始、每次试验溶液更新前后或至少每周1次；pH值应在试验开始和每次更新前后测定。流水式试验系统中，至少每周测定1次pH值。每个试验应测定1次总硬度。此外，至少在1个试验容器中连续监测水温。8.5.2.1试验结束时，对所有存活的鱼应按试验容器称湿重(吸干水分)或逐尾称湿重。通常宜称总重。8.5.2.2试验期间每天观察记录所有外部异常现象(例如出血、变色)和异常行为。记录所有死亡率，并尽快移除死鱼。不应替换死鱼，承载量和饲养密度应符合要求，避免因试验容器中鱼的数量变化对试验鱼生长造成影响，喂食量应相应调整。9质量控制试验有效性应满足以下条件：a)试验结束时对照组鱼的死亡率小于或等于10%;b)对照组鱼的平均质量增长应大于或等于50%初始平均体重；c)试验期间溶解氧浓度不低于空气饱和值的60%;d)试验期间，各试验容器间的水温差不超过±1℃,并应维持在稀有鲍鲫适宜温度范围内，且试验期间偏差不超过2℃,且符合附录A的规定。10数据与报告10.1数据处理10.1.1对死亡率超过10%的容器不计算生长率。计算所有试验浓度的死亡率。10.1.2时间t₁和t₂间的特定生长率(r),按式(1)和式(2)计算：式中：r₁——每个容器的鱼平均特定生长率，单位为每天(d-1);W₁、W₂——某尾鱼分别在时间t₁与t₂时的体重，单位为克(g); (1) (2)lnW₂——试验结束期间单尾鱼的体重对数；lnW₂——试验结束期间容器中鱼重W。对数的平均值；lnW₁——试验开始期间容器中鱼重W₁对数的平均值；t₁、tz——试验开始与试验结束的天数；r₂——“假定”的特定生长率，单位为每天(d-l)。r₁和r₂根据0d～28d计算，理想的结果按0d～14d和14d～28d计算(如果在试验进行14d时测量)。610.2统计分析10.2.1结果的回归分析(浓度-反应模型)10.2.1.1符合特定生长率与浓度之间的数学关系，用于估算ECr。可根据每个容器的鱼平均特定生长率(r₁)进行分析。10.2.1.2绘制每个容器的鱼平均特定生长率(r₁)与浓度的关系图。10.2.1.3选择恰当的模型，并有适当的理论支持。10.2.1.4如每个试验容器中存活的鱼数不相等，建立模型时应称重。10.2.1.5模型建立的方法应能估算出效应值[例如EC2及其离差(置信限)]。拟合模型图应能显示与数据的关系。10.2.2.1如试验中每个浓度组都有平行，LOEC可根据容器平均特定生长率的方差分析(ANOVA)估计，采用合适的方法(例如Dunnett's或Williams’检验),将每个浓度组的r平均值与对照组的r₁平均值比较，确定差异存在统计学意义(p<0.05)的最低浓度。如假设分析的参数法无法满足非正态分布(例如Shapiro-Wilk检验)或非齐性方差(Bartlett's检验),则应考虑在方差分析前将数据转换为齐性方差，或进行加权方差分析。10.2.2.2如试验中每个浓度没有平行，LOEC可根据由单尾鱼得出的“假定”的特定生长率r₂来进行方差分析估计。将每个试验浓度组的r₂平均值与对照组的r₂平均值进行比较，确定差异存在统计学意义(p<0.05)的最低浓度。10.3试验报告试验报告应至少包括试验名称、试验目的、试验原理、试验的起止日期及下述内容。a)受试物：物理性质及相关理化特性、基础信息(见第4章)等。b)稀有鲍鲫：c)试验条件：2)试验设计：试验容器数、试验浓度和平行数、每个容器中的鱼数；3)贮备液的配制方法和更新频率(如果使用溶剂，给出其化学名和浓度);4)试验配制浓度、实测浓度及标准差、受试物水溶液中的分析方法；粒物、盐度(如果需要)及其他测定数据；7)喂食的详细信息：饵料种类、来源、喂食量和喂食频率。d)试验结果：1)对照组总存活率以及所有试验浓度组中的死亡率数据；2)所用的统计分析方法，基于平行或鱼进行统计，数据处理与所用方法的理由；3)列表数据包括：在0d、14d(如果测定)以及28d时的个体体重或平均鱼重，在0d～28d期间、0d～14d和14d～28d期间的容器平均鱼重或假定的特定生长率(如合适);4)统计分析结果，以表格和图形表示，包括LOEC(p<0.05)、NOEC和/或EC,及其95%置7信限(如可能);5)所有鱼的异常反应，以及由受试物引起的各种可观察效应。e)结果讨论：如试验溶液中的受试物实测浓度与分析方法的检出限在数量级上接近时，或在半静态试验中，新配制的试验溶液与更新前的试验溶液间受试物浓度降低时，应慎重解释结果。8(规范性)稀有鮑鲫的选择和适宜的试验条件稀有鲍鲫的选择和适宜的试验条件应符合表A.1的规定。表A.1稀有鮑鲫的选择和适宜的试验条件种类试验温度范围℃光照周期h鱼龄月初始鱼重范围g测量精度承载量饲养密度尾/L饵料试验周期d稀有鲍鲫0.050～0.10010.2～1.05～10活饵料9(规范性)合格试验用水的化学特性合格试验用水的化学特性应符合表B.1的测定。表B.1合格试验用水的化学特性总颗粒物总有机碳未离解氨残留氯总有机磷农药总有机氯农药与多氯联苯等总有机氯(资料性)