核酸合成 第1部分：合成寡核苷酸的生产和质量控制要求

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中华人民共和国国家标准

GB/TXXXXX—XXXX

`

核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生产

和质量控制要求

Nucleicacidsynthesis-Part1:Requirementsfortheproductionandqualitycontrolof

synthesizedoligonucleotides

(ISO20688-1:2020,IDT)

（征求意见稿）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

GB/TXXXXX—XXXX

目次

前言III

1范围1

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4寡核苷酸的设计和选择2

5一般质量管理要求2

5.1一般要求2

5.2寡核苷酸分级2

5.3控制文件2

5.4质量管理体系2

5.5人员和培训3

5.6安全控制3

6资源管理3

7生产工艺要求3

7.1总则3

7.2寡核苷酸合成3

7.3纯化3

7.4质量控制检查4

7.5干燥4

7.6配制错误!未定义书签。

8质量控制过程要求4

8.1总则4

8.2分析方法的确认与验证4

8.3鉴定与纯度4

8.3.1碱基序列的鉴定4

8.3.2纯度4

8.3.3杂质5

8.4定量5

8.4.1总则5

8.4.2浓度5

8.4.3质量5

8.5摩尔质量和/或碱基长度5

8.6退火温度6

8.7报告6

8.8纠正措施和改进的验证7

9合成寡核苷酸（RNA）的附加要求7

I

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附录A（规范性）过程检查表8

附录B（规范性）装置和设备清单及其控制标准9

附录C（规范性）摩尔质量和摩尔数的计算10

附录D（规范性）采用质量分析法验证寡核苷酸序列12

附录E（规范性）采用经过认证的标准物质对测量仪器的精度进行控制—示例错误!未定义书

签。

附录F（规范性）Tm值的计算方法错误!未定义书签。

参考文献错误!未定义书签。

II

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核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生产和质量控制要求

1范围

本文件规定了合成寡核苷酸（通常最多250个碱基）的生产和质量控制要求。

本文件还描述了合成寡核苷酸的一般质量指标以及质量评价指标的常用方法。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

有证标准物质certifiedreferencematerial

CRM

附有由权威机构发布的文件，提供使用有效程序获得的具有不确定度和溯源性的一个或多个特性值

的标准物质。

[来源：ISOGuide30:2015,2.1.2,修改-注释已删除。]

3.2

性能performance

<合成寡核苷酸>具有满足合成特定目的用途（包括生物学测定法）的寡核苷酸的能力。

注1：合成的寡核苷酸在作为PCR引物的情况下，合成的寡核苷酸具有引物的性能。

注2：合成的寡核苷酸在作为探针以用于DNA微阵列、实时PCR或NGS的情况下，合成的寡核苷酸具有与靶核酸特异性

杂交的能力。

注3：通过评估寡核苷酸在其各自用途中的功能来确认其性能。

3.3

纯度purity

<合成寡核苷酸>合成寡核苷酸的预期序列和/或长度与寡核苷酸总量之间的比率。

注：合成寡核苷酸的纯度是对应于合成寡核苷酸的预期序列和/或长度的吸收峰面积与寡核苷酸的总峰面积的比率。

通过高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）计算260nm处的吸光度（OD260）。纯度是根据HPLC或CE或质

谱仪的结果通过面积归一化法计算的。

3.4

标准物质referencematerial

RM

具有一种或多种足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性适用于测量过程中的预期用途。

[来源：ISOGuide30:2015，2.1.1，修改-注释已删除。]

3.5

合成寡核苷酸syntheticoligonucleotides

用化学方法合成的DNA（脱氧核糖核酸）或RNA（核糖核酸）。

1

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注1：各种化合物（例如修饰的碱基、碱基类似物、末端标记试剂、荧光化合物等）均可以引入到合成的寡核苷酸

中。

注2：本文件中的合成寡核苷酸是单链的、线性的，长度从大约10个到250个核苷酸。

4寡核苷酸的设计和选择

合成寡核苷酸的质量和一致性要求依据其预期用途有差异。例如，引物和探针在聚合酶链反应（PCR）

或微阵列或NGS中的质量要求不同。

通常，用户负责指定具体用途的寡核苷酸的质量要求。

用户可以从生产商提供的质量等级列表中选择符合预期用途的质量等级，例如“基因组等级”或“反

义等级”（参见5.2）。

健全的质量管理和检测以及对质量控制要求的共识，可以达成一致信息，以便：

——用户适当地选择符合预期用途的寡核苷酸；

——用户和生产商能够更好地沟通，并就定制寡核苷酸的要求达成一致。

5一般质量管理要求

5.1一般要求

合成寡核苷酸的生产者（以下称为“生产者”）应建立并实施一种程序，包括描述并保存记录以下

过程：

a)订单信息；

b)寡核苷酸的生产；

c)质量控制要求。

应制定订单接收过程中的质量方针和质量目标。用户的质量要求可能因其预期用途、实验方法的设

计以及影响重复性和再现性结果因素的差异而变化。生产商应根据订单信息明确质量方针、质量目标和

合成寡核苷酸的等级（如适用），根据质量等级表等方式监控是否按照相应的工艺进行生产（示例见附

录A）。此外，应在生产过程中采取必要的措施，通过测量和分析所生产的合成寡核苷酸的质量来达到

预期的结果。

5.2寡核苷酸分级

为了减少对质量要求的过度定制，可以考虑对寡核苷酸质量进行分级。生产商在记录寡核苷酸质量

等级时，应根据预期用途确定等级。应选择和确定符合每个等级的纯化方法，见7.3。

5.3控制文件

生产商应制定一套程序，确保对程序化信息（包括本文件要求的记录）进行受控，并应确保防止任

何作废文件的非预期使用。文件信息包括记录保存在电子媒介中时，生产者应确保对电子媒介的受控。

5.4质量管理体系

生产者应建立质量管理体系。质量管理体系应建立必要的程序，并确保生产根据程序进行控制。应

定期检查合成寡核苷酸的生产是否正确执行本文件规定的质量管理体系。

注：对于标记的寡核苷酸，可根据标记的特性考虑其他质量指标，例如荧光强度和波长。

2

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5.5人员和培训

生产商应确保人员具备执行本文件规定的程序的能力，并对其进行适当监督。生产商应向人员提供

适当的培训和能力监控。

5.6安全控制

生产商应根据适用要求制定安全计划，以确保本文件规定的寡核苷酸合成人员和纯化人员的安全。

6资源管理

生产商应确保生产寡核苷酸的设施和区域环境处于适当的条件下。生产者应当维护生产合成寡核苷

酸的设备和仪器。生产者应当对可能影响合成寡核苷酸质量的原料（包括试剂、纯水和辅助材料）进行

妥善监控。

附录B列出了适合生产合成寡核苷酸的设备和仪器示例。

7生产工艺要求

7.1总则

单序列合成寡核苷酸的生产通常包括以下过程：

a)合成；

b)纯化；

c)质量控制检查；

d)干燥（如适用）；

e)分装。

这些过程应使用经过定期维护/校准的仪器进行，例如移液管或干燥器。

注1：有几种用于生产复杂的寡核苷酸库的生产工艺。例如，几个寡核苷酸组合成复杂的寡核苷酸库。或者，通过

基于阵列的合成产生复杂的寡核苷酸库。可根据生产方法选择和实施适当的质量控制措施。

注2：确定质量属性的常规方法不一定适用于基于阵列的合成。

注3：在某些情况下，单序列寡核苷酸是用兼并碱基合成的，用于非特异性退火的特定应用。在这种情况下，碱基

在一个特定的位点被横移或转换。

7.2寡核苷酸合成

应使用经过定期校准和维护的测量仪器进行质量控制检查。

寡核苷酸合成仪应定期维护和保养。操作人员应按照文件程序进行资格认证。应保存与实验操作有

关的记录。

7.3纯化

应根据寡核苷酸设计规范的风险、与用户协议的预期用途，选择适当的纯化设备和方法。

纯化方法包括：反相高效液相色谱（反向HPLC）纯化、阴离子交换高效液相色谱（SAX、WAX）、

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、寡核苷酸纯化柱（OPC）、高纯度无盐（HPSF）纯化和直接沉淀（脱

盐）。纯化方法可根据寡核苷酸的预期用途选择。应保留所用方法的记录。

纯化设备应由有资质的人员进行操作。与操作有关的记录应予以保存。

3

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7.4质量控制检查

应使用经过充分校准和维护的测量仪器进行质量控制检查。测量操作应由有资质的人员按照文件程

序进行，并保留操作记录。对寡核苷酸的特性、纯度、杂质、量和其他与预期用途有关的重要属性应进

行质量控制。

7.5干燥

干燥可采用离心蒸发、冷冻干燥或空气干燥设备进行。

这些操作应由有资质的人员按照程序文件进行，并保留操作记录。

7.6分装

这些操作应由有资质的人员按照程序文件执行，并保留操作记录。

8质量控制过程要求

8.1总则

质量控制过程应确定寡核苷酸与其预期用途有关的特性、纯度、杂质、量和其他重要属性。

应选择适当的方法并进行验证，以确定寡核苷酸的特性和质量。

测量工作应由有资质的人员进行。

8.2分析方法的确认与验证

用于进行质量控制和检测质量属性的分析方法应得到验证和确认。仪器应使用有证标准物质进行校

准。

注：附录E描述了使用有证标准物质对测量仪器进行精度控制的示例。

8.3鉴定与纯度

8.3.1碱基序列的鉴定

碱基序列可通过适当的方法确认，例如电喷雾电离（ESI）或基质辅助激光解析/电离（MALDI）

作为离子源，飞行时间质量分析器（ToF）、离子阱或四极杆质谱仪（MS）用于分子量分析或者测序。

注1：附录D中描述了使用MS确认碱基序列的示例。

注2：MS可用于确认短寡核苷酸的序列，而根据合成寡核苷酸的长度，准确分析序列有一定的局限性。

应记录确认的基本序列标识。

8.3.2纯度

生产商和使用者应就特定用途的寡核苷酸的纯度达成一致。

示例：合成寡核苷酸的纯度可确定为预期寡核苷酸量与寡核苷酸总量之比。预期的寡核苷酸是具有“预期长度”和

/或正确序列的寡核苷酸。

测定纯度的方法可包括以下一种或结合多种方法：

a)分析用反相或离子交换高效液相色谱法；

b)经验证的有线性响应的毛细管电泳或平板凝胶电泳；

c)质谱（例如，ESI或MALDI作为离子源，ToF、MS作为分子量分析仪）；

d)测序。

注：合成的寡核苷酸是复杂的分子，根据寡核苷酸的设计和生产工艺，会产生不同的结果。

4

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应记录测定的纯度。

8.3.3杂质

在某些应用中，杂质的测定是很重要的。

生产商和使用者应就特殊用途的寡核苷酸杂质的可接受程度或范围确定并达成一致。一般来说，杂

质是指干扰预期用途的寡核苷酸的含量。应采用适当的方法测定杂质的含量。

注：杂质包括但不限于有机溶剂、单核苷酸、短核酸和序列错误的核酸。

杂质测定方法包括以下一种或多种方法：

a)分析用反相或离子交换高效液相色谱法；

b)经验证的有线性响应的毛细管电泳或平板凝胶电泳；

c)质谱（TOF或ESI）；

d)测序。

应记录测定的杂质。

8.4定量

8.4.1总则

应按照事先商定的预期用途提供足够量的合成寡核苷酸。

生产商应确认合成总量符合用户要求。

应记录协商的合成寡核苷酸的总量。

8.4.2浓度

寡核苷酸浓度的测量可作为生产或产品测试（检查）过程中质量控制的一部分。吸光度可以用来测

量溶液中寡核苷酸的浓度。通常，使用260nm处的吸光度。

摩尔浓度是根据摩尔消光系数和OD值公式（C.1）计算的，摩尔消光系数的参数见附录C。

由于在计算摩尔消光系数时使用了不同的假设，摩尔消光系数数据（包括使用的假设）均应被记录。

其他方法，如高效液相色谱法，使用寡核苷酸参考物质或有证标准物质（如果适用），在证明与光

密度的相关性后，也可用于测量浓度。

应记录测量的浓度。

8.4.3质量

质量应以纳克（ng）或可溯源至SI单位的形式记录。

质量通过公式（1）来计算：

m=푂퐷260×푉푓×퐶×퐷·······································································(1)

式中：

m————质量，单位为ng；

OD260——260nm处的吸光度；

Vf————液体体积，单位为毫升（mL）；

C—————换算系数，单位为ng/mL；

D—————稀释因子。

8.5摩尔质量和/或碱基长度

5

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应检测并记录合成寡核苷酸的摩尔质量和/或碱基长度。摩尔质量可以用质谱（包括ESI或MALDI作

为离子源，ToF、MS作为分子量分析仪）直接测定，也可以通过平板电泳仪或毛细管电泳仪间接测定。

应由有资质的人员进行确认，并保留记录。

质谱是一种测量分子量的方法。使用质谱时，合成寡核苷酸的摩尔质量可按式（2）计算：

M=[*(#푑퐴×313.20)+(#푑퐶×289.17)+(#푑퐺×329.19)+(#푑푇×304.18)

+(#푑푈×290.16)+(#퐼×314.18)+(#푟퐴×329.19)+(#푟퐶×305.17)

+(#푟퐺×345.19)+(#푟푈×306.15))+(#푟퐼×330.18)−62]+1····································································(2)

式中：

M——摩尔质量，单位为g/mol；

#dA——腺嘌呤（脱氧核糖核酸）的数量；

#dC——胞嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#dG——鸟嘌呤（脱氧核糖核酸）的数量；

#dT——胸腺嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#dU——尿嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#I——肌苷（脱氧核糖核酸）的数量；

#rA——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rC——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rG——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rU——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rI——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

注1：注1：更多信息见参考文献以及C.1和表C.1。

注2：公式（2）可用于计算基于3'端修饰的磷酸的摩尔质量。

使用不同的公式时，应予以记录。

修饰的寡核苷酸的摩尔质量可由C.2中所示修饰化合物的摩尔质量值来计算。

8.6退火温度

Tm值可通过附录F中的公式（F.1）计算。计算时应记录Tm值。

8.7报告

合成寡核苷酸的报告单，应包括但不限于以下内容：

a)产品标识；

b)产品批号；

——生产过程和质量控制可追溯；

c)订单的使用者；

d)纯化方法；

e)寡核苷酸序列；

——描述应采用IUPAC代码的形式，示例见附录C；

f)摩尔质量；

注1：见公式（2）。原则上，寡核苷酸部分的摩尔质量不包括带有连接臂的修饰物，并且不包含5'端的磷酸基团。

g)用于计算摩尔质量的公式；

h)OD单位；

注2：OD是一种广泛使用的表示寡核苷酸量的单位。

注3：见8.4.3.

6

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i)摩尔消光系数数据，包括假定的数据；

注4：见公式（C.1）.

j)总摩尔数；

注5：可根据表C.1中所示的吸光度指数和附录C中描述的公式（C.1）计算该值。

k)退火温度；

l)鸟嘌呤胞嘧啶（GC）含量；

m)推荐（例如特定的缓冲液，包括TE缓冲液）用于稀释合成寡核苷酸的溶液；

n)有效期；

——有效期应根据经验确定——可根据类似寡核苷酸稳定性研究的结果估计保质期；

注6：例如，干粉在4°C下的典型保质期为两年，溶液在−20°C下经典保质期为一年。

o)储存条件；

——储存条件应根据经验确定；

——可根据类似寡核苷酸稳定性研究的结果，确定储存条件。

注7：原则上，干粉储存在4°C，溶液储存在-20°C，但可根据用户和生产商之间的协议使用不同的温度范围。

p)运输条件。

8.8纠正措施和改进建议

质量管理体系应采取纠正措施消除包括不合格和顾客对产品的投诉等问题的原因。当发现产品有问

题需要改进时，应考虑采取适当的纠正措施。质量管理体系应保存纠正措施或改进的记录。质量管理体

系应定期审查纠正措施和改进的情况。

9合成寡核苷酸（RNA）的附加要求

第4条至第8条所述的质量管理体系要求也应适用于合成RNA。

此外，由于RNA易被酶降解，以下附加要求也适用于RNA：

a)应使用经消毒的无核酸酶的设备，如容器或吸头。

b)生产用纯水或缓冲溶液应由受控过的纯水系统制成。应定期检查所采用的纯水系统制备的水

的电导率。试剂应在受控条件下在适当的设施中制备，以避免核酸酶的污染。此外，对于干

粉状态的产品，应在打开密封容器后立即使用试剂。试剂应在干粉的状态下运输。当产品以

溶液形式运输和储存时，应保持冷冻状态运输，且储存在−80°C中。

7

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AA

附录A

（规范性）

过程检查表

表A.1提供了可用于合成寡核苷酸合格性评估的检查表示例。

表A.1工艺检查表

一致性

流程要求章节

合格不合格不适用文件和章节

生产编号

客户信息

序列信息

修饰

订单接收过程纯化方法

订单接收日期/交

货期

订单接收负责人

产量

设备管理

合成

合成负责人

生产过程纯化

纯化负责人

定量测量

定量测量负责人

质量控制

设备控制

质量控制过程质量控制负责人

报告编写

报告编写负责人

运输过程运输负责人

质量经理

培训/资质

法律要求

总则

纠正措施

文件控制

记录控制

8

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BB

附录B

（规范性）

装置和设备清单及其控制标准

设备和装置清单及其控制标准示例见表B.1.

表B.1设备和装置及其控制标准清单

装置类型规格预期用途要求检查频率

温控设备安装时、安装后每

温度稳定性和均匀性

（培养箱、两年，以及维修后

——储存试剂

冰箱、冷冻

温度检查每天

机等）

纯水生产

——质量控制电导率检查每周

系统

至少使用两种质量合格的可

pH计——试剂制备每天或使用时

溯源的缓冲溶液进行校正

零点确认和读数检查采用标

称重设备——试剂制备每天或使用时

准重量，或执行内置性能检查

移液器a

——试剂分配校准并检查移液量的准确性定期

离心机

——离心运转正常，无异常响声使用时

寡核苷酸能够通过β-氰乙基亚磷酰胺法合成寡核苷酸

寡核苷酸合成检查阀门和试剂流量定期a

合成仪的装置1），2）

自动移液试剂或合成寡核

自动移液机器人等检查移液量的准确性定期a

系统苷酸等的分液

可以安装适当的色谱柱，并配备可测量254nm-

高效液相检查内置性能和色谱柱的有

260nm的吸收波长的检测器，以及能够在需要寡核苷酸纯化定期a

色谱系统效性。

汇总峰面积的记录器和馏分采集器。

能够在自然条件和变性条件下进行聚丙烯酰

具有分离和检测相应摩尔质

电泳设备胺或琼脂糖凝胶电泳的设备以及检测设备，如确认碱基长度定期a

量标记的能力。

紫外线灯。

能够在自然或变性条件下分离合成寡核苷酸

毛细管电具有分离和检测相应摩尔质

的装置，并配有检测器和记录装置，可对峰面确认碱基长度定期a

泳系统量标记的能力。

积进行汇总。

合成寡核苷酸的

内置性能检查。定期a

分光光度得量测定

单光束或双光束分光光度计。

计合成寡核苷酸的

用滤光片b进行校准。定期a

得量测定

a考虑正常使用方式及其频率（见ISO9001或与组织质量管理体系相关的标准），确定检验频率，以确保其适用于

目的。

b例如，一种光学玻璃滤波器，它是为光谱光度计的校准而设计的。

9

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CC

附录C

（规范性）

摩尔质量和摩尔数的计算

C.1计算摩尔质量和摩尔消光系数所需的信息

计算摩尔质量（见8.5）和摩尔消光系数所需的信息见表C.1和C.2。这里给出的信息是常见示例的

部分列表，尤其是关于带标签的表单。

合成寡核苷酸的摩尔数可用吸光度（用OD值表示）除以摩尔消光系数计算。

pH值为7.0和260nm时的摩尔消光系数可按式（C.1）计算：

ε=(#푑퐴×15.2)+(#푑퐶×7.4)+(#푑퐺×11.8)+(#푑푇×8.8)+(#푑푈×10.1)+(#퐼×12.1)+

(#푟퐴×14.9)+(#푟퐶×7.55)+(#푟퐺×13.6)+(#푟푈×10)+(#푟퐼×12.1)···············································(C.1)

式中：

ε——摩尔消光系数，单位为l×mol−1×cm−1；

#dA——腺嘌呤（脱氧核糖核酸）的数量；

#dC——胞嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#dG——鸟嘌呤（脱氧核糖核酸）的数量；

#dT——胸腺嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#dU——尿嘧啶（脱氧核糖核酸）的数量；

#I——肌苷（脱氧核糖核酸）的数量；

#rA——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rC——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rG——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rU——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

#rI——腺嘌呤（核糖核酸）的数量；

公式（C.1）不适用于修饰寡核苷酸。

如果8.7中有记录和报告，则可以使用不同的公式。

表C.1碱基分子的摩尔质量和摩尔消光系数（不带保护基）

pH值为7.0和260nm时的摩尔消光系数

IUPAC代码摩尔质量ag×mol−1

l×mol−1×cm−1

dA313.2015.2

dC289.177.4

dG329.1911.8

dT304.188.8

dU290.1610.1

rA329.1914.9

rC305.177.55

rG345.1913.6

rU306.1510

I314.1812.1

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pH值为7.0和260nm时的摩尔消光系数

IUPAC代码摩尔质量ag×mol−1

l×mol−1×cm−1

rI330.1812.1

a摩尔质量是水溶液中的摩尔质量。

C.2计算摩尔质量和摩尔消光系数的附加参考

表C.2是广泛使用的修饰基团示例的部分清单。

表C.2修饰基团

激发波长发射波长

摩尔质量摩尔消光系数

位点修饰λmaxλ

g×mol−1l×mol−1×cm−1

nmnm

5'-Cy5534.6250000(650nm)643667

5'-Cy3507.6150000(550nm)550570

5'-Cy5(viaaminomodified)817.0250000(650nm)643667

5'-Cy3(viaaminomodified)791.9150000(550nm)550570

5'-Amino179.2———

5'-Biotin405.5———

5'-Thiol329.4———

5'-6-FAM537.583000(496nm)496516

3'Cy5(viaaminomodified)848.0250000(650nm)643667

3'Cy3(viaaminomodified)820.9150000(550nm)550570

3'Amino208.2———

3'Biotin(withTEGlinker)569.6———

3'Thiol(beforereduction)244.3———

3'TAMRA626.795000(546nm)546576

7-deazapropagylamino

3'351.26———

dA

7-deazapropagylamino

3'368.26———

dG

3'N2-aminohexyldG429.39———

3'5-aminohexyldC457.43———

3'5-aminohexyldT458.41———

3'5-fluoresceindC874.91———

3'5-TAMRAdC815.73———

3'5-TAMRAdT875.9———

3'5-fluoresceindT816.72———

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DD

附录D

（规范性）

采用质量分析法验证寡核苷酸序列

D.1总则

本附录提供了使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-ToF-MS）和电喷雾电离四极杆

质谱仪（ESI-Q-MS）通过离子源衰变（离子化？）对寡核苷酸进行碱基序列分析的示例。

D.2MALDI-TOF-MS实验方案

a)样品前处理

——将每种分析物溶解在纯水中，使最终浓度为50pmol/μL。取1μL样品溶液和0.5μL基质溶液

点在MALDI板上。然后，将MALDI板风干，加载到装置中，最后进行质谱分析。

注：基质溶液为20mg/mL2,4-二羟基苯乙酮（DHAP）和70mmol柠檬酸二铵的50%乙腈溶液。

b)MALDITOF测试条件

——试验条件见表D.1.

表D.1MALDI-TOFMS测试条件

测试设备基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪

特点光源：氮气激光器（λ=337,1nm）

加速电压20kV

延迟提取针对m/z3000优化

飞行模式线性模式（阳离子检测模式）

测量范围m/z1-15000

5＇-ATGCGTTCCTTCAGCCTGTCCACTA-3＇

12

GB/TXXXXX—XXXX

X质荷比；

Y强度。

图D.1合成寡核苷酸的质谱结果示例

利用D.2中描述的条件，用MALDI-ToF-MS分析合成的寡核苷酸。使用原始分析软件，图D.1中所示的

每个峰与寡核苷酸中指定位置的每个核苷酸相关。

D.3ESI-Q-MS实验方案

a)样品前处理

1)将每种分析物溶于纯水中，终浓度为10pmol/μL。柱上的质量负荷保持恒定，上样量为

50pmol或5μL。

2)流动相A:15mMTAE缓冲液，400mM六氟-2-丙醇（HFIP）的pH8.0的水溶液。

3)流动相B:15mmTAE（TAE）缓冲液，400mMHFIP的甲醇溶液。

表D.2HPLC梯度表

时间（min）流速（mL/min）%A%B

00.281.019.0

15.00.273.526.5

16.00.250.050.0

17.00.281.019.0

21.00.281.019.0

b)ESI-Q-MS测试条件（见表D.3）

表D.3ESI-Q-MS测试条件

测试设备（液相色谱）超高效液相色谱法

测试设备（检测器）质谱仪

色谱柱寡核苷酸分离柱，1.7μm，2.1mm，50mm

柱温60°C

样品温度