分子体外诊断检验 冷冻组织检验前过程的规范 第3部分：分离DNA

ICS11.100.10

CCSC30

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

`

分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的

规范第3部分：分离DNA

Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsfor

pre-examinationprocessesforfrozentissue—Part3:IsolatedDNA

(ISO20184-3:2018,IDT)

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件是GB/T42080《分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范》的第3部分。GB/TXXXXX

已经发布了以下部分：

——第1部分：分离RNA；

——第2部分：分离蛋白质。

本文件等同采用ISO20184-3:2018《分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第3部分：分

离DNA》。

本文件做了下列最小限度的编辑性改动：

删除ISO20184-3:2018的前言和引言；

用适用的我国标准化文件替换“规范性引用文件”中ISO/IEC国际文件；

用适用的我国标准化文件替换“术语和定义”中的ISO/IEC国际文件；

用适用的我国标准化文件替换“参考文献”中ISO/IEC国际文件。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由国家药品监督管理局提出。

本文件由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会（SAC/TC136）归口。

本文件起草单位：

本文件主要起草人：

II

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

引言

分子体外诊断（包括分子病理学）使医学取得了重大进展。随着用于分析人体组织和体液中的核酸、

蛋白质和代谢物的新技术的出现，预计将取得进一步进展。然而，这些分子的完整性和图谱在标本采集、

运送、贮存及处理过程中可能发生变化，因此使得诊断或研究的结果不可靠或甚至不可能。这是因为在

随后的检验分析中不会考虑患者的实际情况，而是参考在检验前生成的人工图谱。因此需要使从标本采

集到检验整个过程标准化。

GB/T42080《分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范》规定了冷冻组织的分子体外诊断检

验的检验前操作步骤的标准化要求，拟由3个部分组成。

第1部分：分离RNA。目的在于规范化冷冻组织的RNA检验的标准化检验前操作步骤，减少RNA谱

的变化，保障后续检验结果的有效性和可靠性。

第2部分：分离蛋白质。目的在于规范化冷冻组织的蛋白质检验的标准化检验前操作步骤，减少蛋

白质谱变化和修饰。

第3部分：分离DNA。目的在于规范化冷冻组织的DNA检验的标准化检验前操作步骤。

组织中的DNA的完整性在加工和贮存过程中可能发生变化。DNA分子的修饰能影响检验结果

的有效性和可靠性。有必要采取特殊措施，尽量减少所描述的DNA的变化和修饰，以备后续检验。

因此，需要对从标本采集到DNA检验的整个过程进行标准化。已经进行了研究，以确定重要

的影响因素。本文件借鉴了这项工作，将冷冻组织在所谓的检查前阶段进行DNA检验的步骤编纂

和标准化。

在本文件中，使用了以下助动词：

-“应”表示一项要求；

-“宜”表示一项建议；

-“可”表示许可；

-“能”表示一种可能性或能力。

III

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第3部分：分离DNA

1范围

本文件提供了在进行分子分析之前的检验前阶段，用于DNA检验的冷冻组织标本的处理、记录、贮

存及取材的要求和建议。

本文件适用于医学实验室和分子病理实验室对冷冻组织中提取的蛋白质进行的分子体外诊断检验，

包含实验室自建检测。本文件也适用于实验室客户、体外诊断开发者和制造商、生物样本库、开展生物

医学研究的机构和商业组织、以及监管机构。

本文件不包括冷冻前经过化学稳定预处理的组织。

注：国际、国家或地区法规或要求同样能适用于本文件所涵盖的特定内容。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T22576.1-2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）

3术语和定义

ISO15189界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

ISO和IEC维护的用于标准化的术语数据库，地址如下：

——ISO在线浏览平台：可在/obp上获得。

——IEC电子百科：可在/上获得。

3.1

等分样品aliquot

假定取样误差忽略不计时，大量均质物质的一部分。

注1：该术语通常适用于液体。组织是异质的，所以不能等分。

注2：该定义源于第[22],[23],[24]条参考文献。

3.2

环境温度ambienttemperature

未经调节的周围空气的温度。

3.3

分析物analyte

4

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

被测量名称所代表的组分。

[来源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]

3.4

分析检测性能analyticaltestperformance

测量待测分析物的检验的准确度、精密度和灵敏度。

注：也能适用于其他试验性能特性，比如稳健性、重复性等。

3.5

生物样本库biobanking

获取和贮存生物材料以及相关信息和数据的过程，以及与采集、制备、保存、检测、分析和分发有

关的部分或全部活动。

3.6冷缺血coldischemia

组织自人体取出后至稳定或固定前的存在状况。

3.7

诊断diagnosis

从其体征和/或症状中识别健康或疾病状态，诊断过程能通过各种检验对个体状况进行分类，分成

不同的类别或亚类，以便做出关于治疗和预后的医学决策。

3.8

DNA

脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid

以双链或单链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合体。

[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2]

[来源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]

3.9

DNAase

脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease

催化DNA降解成更小组分的酶。

3.10

检验examination

分析检测analyticaltest

以确定一个特性的值或特征为目标的一组操作。

注：从分离的分析物开始、包括各种用于定性或定量检验的参数测试或化学操作的过程。

[来源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,删除原注1~3，补充新注，“分析检测”被添加为首选术

语。]

3.11

大体检查grossing,grossexamination

5

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

为获得诊断信息，在准备后续显微镜检查过程中对病理标本所做的肉眼检查。

3.12

均质homogeneous

结构和组成均匀

3.13

干扰物质interferingsubstances

能改变检验（3.10）结果的标本（3.18）/样品（3.17）中的内源性物质或外源性物质（如：稳定剂）。

3.14

检验前过程pre-examinationprocess

分析前阶段preanalyticalphase

分析前工作流程preanalyticalworkflow

按时间顺序从临床医生的申请开始，包括检验（3.10）申请、病人的准备和身份识别、原始样品（3.18）

的采集、运送到医学或病理实验室和在实验室内进行运送、分析物（3.3）的分离并以分析检验（3.10）

开始为结束的过程。

注：检验前阶段包括影响预期检验（3.10）结果的准备流程。

[来源：GB/T22576.1-2018，3.15，有修改]

3.15

能力验证proficiencytest

利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。

[来源：GB/T27043-2012,3.7，有修改]

3.16

室温roomtemperature

本文件中是指18℃-25℃。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.19]

注：地方或国家法规可能存在不同定义。

3.17

样品sample

取自原始样品（3.19）的一部分或多部分。

[来源：GB/T22576.1-2018，3.24，有修改]

3.18

原始样品primarysample

标本specimen

为检验（3.10）、研究或分析一种或多种量或特性而取出的认为可代表全部的一独立部分的体液、

呼出气、头发或组织。

[来源：GB/T22576.1-2018，3.16，有修改]

6

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

3.19

稳定性stability

在特定条件下贮存时，样品（3.17）材料在特定时间内保持规定特性值在特定范围内的能力。

注：本文件涉及的分析物（3.3）是所分离的DNA（3.7）。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.15，有修改]

3.20

贮存storage

在适宜的条件下长时间中断样品、分析物或其衍生物（如染色切片或组织块）的分析前工作流程，

以保持其特性。

注：通常在实验室档案库或生物样本库中进行长时间贮存。

3.21

确认validation

通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。

注：“已确认”一词用于表明相应的状态。

[来源：GB/T19000-2016，3.8.13，有修改，删除原注1和注3。]

3.22

验证verification

通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。

注1：“已验证”一词用于表明相应的状态。

注2：认定能包括以下活动

进行替代计算；

将新的设计规范与类似的经验证的设计规范进行比较；

进行检测和演示；

在发布前审查文件。

[来源：GB/T19000-2016，3.8.12，有修改]

3.23

热缺血warmischemin

失去正常血液供应的组织从身体内移除前的状态。

注：正常血液供应的中断因病例而异。因此，热缺血持续时间及其影响取决于个体情况，也能取决于动

脉供血的解剖结构。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.25]

3.24

工作流程workflow

完成任务所需的一系列活动。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.26]

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

4总则

医学实验室质量管理体系的通用要求，特别是关于标本采集，接收和处理（包括避免交叉污染），

参见GB/T22576.1-2018条款4.2,5.4.4,5.4.6或GB/T27020-2016条款8和7.2。有关实验室设备、试剂和消

耗品的要求应遵循GB/T22576.1-2018条款5.3、GB/T22576.1-2018条款和或GB/T

27020-2016条款6.2。

检验前、检验中和检验后（即整个工作流程）的所有步骤都能影响诊断或研究结果。因此，应在开

发检验的过程中验证和确认整个工作流程。这具体包括所有检验前流程，如检验要求、患者的准备和鉴

定，主要样品的采集（运到医学实验室和在医学实验室内），分析物的贮存和分离。应记录不能完全控

制的工作流程步骤（例如：热缺血）。

与RNA或蛋白质相比，组织中的DNA在热缺血和冷缺血期间相对稳定。对于较长的热缺血和冷缺血

持续时间，DNA序列和拷贝数改变（例如基表基因组杂交（CGH）谱）是未知的【2】。然而，DNA甲

基化谱可能会因缺血而发生变化【10】。宜尽可能短标本冷冻前的持续时间，以避免DNA的酶解。应记

录冷冻前的持续时间，宜记录冷冻前的温度【2】。

在DNA检验的设计和开发过程中，应进行风险评估(另见ISO14974)。在需要时，应制定消除或减少

已识别风险的缓解措施，以确保检验的执行。

关于标本运送和处理的安全说明应符合GB/T22576.1-2018条款5.2.3和5.4.5，以及GB19781。国际、

国家或地区的法规或要求也能适用。

在整个检验前过程中，应采取预防措施，避免不同标本/样品之间的交叉污染，例如，在可行的情

况下使用一次性材料，或在处理不同标本/样品之间进行适当的清洁程序。

如果检验制造商对检验前步骤有明确的说明，应按照这些说明执行。当出于正当理由（例如，未满

足患者需求)，未按照制造商的说明使用商业产品时，用户对其确认、验证、使用和性能负责。

有关标本采集、运送、接收和处理的一般考虑，请参见ISO20658和ISO20387。

5实验室外部

5.1标本采集

5.1.1总则

如果已知预期检验，则应遵循其使用说明，包括对实验前步骤的要求，如标本采集（参见条款6）。

另参见GB/T22576.1-2018,5.4.4。

5.1.2患者/标本供者的信息

记录应包括患者/标本供者ID，能用编码形式。该文件应由负责标本采集的部门记录，并宜包括但

不局限于：

a)患者/标本供者的相关健康状况，例如：健康与否、疾病类型、伴随疾病、人口学信息（如年龄、

性别等）；

b)组织采集前的常规医学治疗和特殊治疗相关信息，例如麻醉剂、药物、外科手术或诊断程序；

c)患者/标本供者的相应的知情同意。

5.1.3标本相关信息

文件记录应包括但不局限于：

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

a)如果检验需要，通过记录缺血相关的血管结扎/夹闭时间点（通常为动脉夹闭时间）来表示体

内缺血开始（热缺血）；

注：不需要进行小组织切片活检切除冷冻。

b)组织离体的时间、日期及离体方式（例如：核芯针穿刺、切除及其他活检装置采样）；

c)组织类型、来源和状况（例如病变组织、未受疾病影响的组织）的描述，包括外科医师、放射

医师或病理医师在手术室内外所做的任何标记；

如果在实验室外进行组织冷冻，则应记录6.2中描述的步骤，需要进行病理评估时，应执行6.3。

文件记录还宜包括标本采集人员身份信息ID，能采用编码的形式。

5.1.4标本处理

需要冷冻用于诊断目的的组织可能来自大标本，也可能来自小标本（例如通过内窥镜检查获取的活

检标本，或者在需要快速冷冻切片诊断的外科手术过程中从患者身上取出的标本）。

a)应记录对离体标本所进行的任何添加或变动，例如油墨标记、缝线、切口等标本的方位标

记。

如果标本需要进行病理诊断，则应由具有医师资格的病理学家采样，或者在其监督、指导下

进行（参见6.2），这些人员宜了解对标本的所有检验，以保证正确处理。

如果在没有病理诊断要求的情况下取出标本，评估标本的选择和记录可由病理学家以外的其

他有资质的人员进行。

b)福尔马林固定能对基于DNA的检验产生负面影响(参见ISO20166-3)。因此，根据具体的分

析检验，首选冷冻组织样品。如果DNA和RNA都要进行检验，请参见1S020184-1。

c)冷缺血能改变DNA（例如甲基化）；因此，只要预期的检验没有不同的规定，标本/样品宜

立即冷冻（参见6.3)。

冷冻能在病理学家的指导或监督下，在实验室外或在实验室内进行。

如果标本或样品在实验室外冷冻，立即进行6.2。

如果标本或样品在实验室内冷冻，则需要将新鲜的组织标本运送到实验室。应立即执行5.2中

描述的新鲜组织运送的步骤。

5.2新鲜组织运送要求

5.2.1总则

如果需要将标本或样品运送到实验室进行冷冻，实验室应与临床或外科部门合作，共同制定有关标

本运送程序的规程。

5.2.2运送准备

应执行以下步骤：

a)选择和使用容器和包装（例如冷却箱、贮存和运输箱、真空包装）；

注1：根据适用的运送规定。

b)选择和使用稳定程序（例如冷却方法）进行运送；

注2：意外冷冻新鲜组织（例如以错误的方式使用冷包）可能导致组织解冻时DNA降解，还

可能影响形态特征。

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

c)容器的标记（例如注册号、条形码、标本类型、数量和等级、来源的器官组织）和其他文件

[5.1.2,5.1.3,5.1.4和5.2.2a）和b）]。

单个容器可只容纳几个标本，如果这些标本取自同一部位（即相似或相应的解剖后者组织器官部

位），并具有相同的大体特征，例如组织类型和疾病状态(如炎症、肿瘤和坏死)。

注3：具有相同大体特征的标本可能具有不同的分子特征。

标本离体后宜立即转移到容器中。然后宜将容器保存在冰上或2℃至8℃，以减少DNA变化（例如碎

裂）。或者，根据预期的检验要求，在室温下短时间暴露(例如≤3小时)也能接受。在检验的开发过程

中，应规定并验证在规定温度范国内的最长储存时间。

宜记录冷缺血期间容器周围环境的温度（例如不同房间的温度，运送温度）。如果未测量温度，则

温度范围宜按环境温度、室温或2℃~8℃估算。

5.2.3运送中

宜以合适的方式进行温度监测（例如温度跟踪）。如果无法测量温度，宜估计并记录运送过程中的

最高温度【例如环境温度，室温，2℃至8℃或冰（袋）】。

如果标本尚未冷冻，宜立即置于冰上或维持温度在2℃~8℃情况下进行即时运送，以尽量减少DNA

谱的变化。

应记录与既定运送程序规程的符合性，并且应描述和记录存在的任何偏离。

6实验室内部

6.1标本接收相关信息

应记录标本接收人员的姓名（能以编码形式）、所接收标本的到达日期、时间及状态（例如标签、

包括温度在内的运输条件、组织类型和标本数量、容器泄漏/破损）。与既定运输程序的任何偏离都应

记录（参见5.2）。

应核对标本标识的正确性：宜包括标本的临床信息（例如类型、大小、数量）（参见5.1.1和5.1.3）、

住院号和/或捐赠者/患者ID、患者姓名、出生日期和组织类型。对于不符合说明书的情况均应记录，例

如标签、贮存和运送条件（温度和持续时间）、标本和泄露/破损的采集容器。

6.2标本病理学评估和样品选择

标本病理学的评估和记录以及从标本中选择用于进一步处理的样品应由具有医师资质的病理医师

完成，或在其监督或负责下完成。

当地、国家或地区法规能适用。

选择用于DNA检验的样品。

a)用于分子和组织病理学检查以及可选的进一步研究目的标本的适当部分的选择应由具有医师

资格的病理学家进行或在其监督下进行，以确保采集样品用于DNA检查不会影响组织病理学

分析。

位。宜对组织进行显微或手工切割以选择或富集疾病的某些细胞特征。

注1：根据当地程序，标本的适当部分的选择也能在实验室外进行，例如，在手术室（参见5.1.4）。

在对手术标本进行大体检查时，应在冷冻前和/或冷冻后检查标本的正确身份。宜核对标本的

临床信息（参见5.1.2和5.1.3）（例如类型、大小、数量），住院号和/或病理学号和/或供者/

患者ID，患者姓名，患者出生日期和组织类型。手术标本和所有发现应根据各医学会的指南

适当描述，并与临床信息和问题相关联。应描述标本的解剖学定位，必要时可标记切除边缘

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

和其他重要区域，有助于以后的显微镜评估；可拍摄照片。应根据各医学学会的器官/疾病相

关指南，获取有代表性的用于显微镜评估的样品（即大体检查）。

注2：上述评估或记录也能在实验室外进行，例如：在手术室。

b)当标本从体内取出而不需要进行组织病理学诊断时，该标本的记录以及样品的评估、选择和记

录可由其他合格人员进行，而不是病理学家。

c)当需要冷冻切片诊断时，应将标本的选定部分冷冻（参见6.3）在适当的冷冻介质中。应记录使

用的冷冻介质。应由具有医学资格（委员会认证）的病理学家对冷冻切片进行评估。

6.3标本或样品的冷冻

应立即冷冻标本或样品。宜选择和使用标本或样品中关于预期用途和工作条件的最佳冷冻方法【参

见下面的1）,2）或3）】。

小瓶在预先冷却之前应贴上标签。

1)急速冷冻程序(snap-freezingprocedure)[10]：这种方法宜是优选，因为它可以最好地保存冷冻组织样品

中的形态。异戊烷（C5H12，也称甲基丁烷或2-甲基丁烷）应预冷，温度范围为≤-80℃至＞-160℃，

能用于急速冷冻。能使用液氮（-196℃），干冰（-80℃），-80℃冷冻箱或专用冷冻设备进行预

冷，这些设备可在控制或不控制冷却速率的情况下使异戊烷保持在≤-80℃。异戊烷应在管子或其

他容器（例如玻璃烧杯）中冷却，以抵抗大的和突然的温度变化。预冷异戊烷的体积应至少为标本

或样品体积的10倍。对于快速冷冻，组织样品应完全浸没在预冷却的异戊烷中。

在组织冷冻后，应将其转移到指定的预冷标记的低温小瓶中。应按照制造商的说明盖上样品瓶。当

在用于急速冷冻的装有异戊烷的试管或容器底部看到沉淀物时，宜更换异戊烷。

异戊烷在室温和压力下是极易挥发且极易燃的液体。因此，实验室宜通风良好。管中的异戊烷宜冷

却。

2)快速冷冻程序(fast-freezingprocedure)：组织应在预先冷却的金属板或置于液氮表面的金属篮上

或干冰上快速冷冻。金属表面应预冷，温度范围为≤-80℃至＞-196℃。能使用合适的支架和

夹具将金属板或金属篮固定到位。或者，样品能直接在液氮中冷冻，或者在液氮或干冰中的

标记和封闭的贮存瓶中冷冻。然而，缓慢的冷冻过程能导致膜破裂，因为盐的浓度升高和晶

体形成能严重影响形态。为避免交叉污染，宜在冷冻样品之间清洗篮子或盘子。

注：在液氮中冷冻的特点是由于其相对较高的温度，液氮在组织周围沸腾引起的莱顿弗罗斯特效应[11]。这减

少了从样品到液氮的热传导；当将样品在冷冻前放入标记的小瓶中时，这种情况会变得更糟。

3)快速冷冻切片诊断的组织冷冻程序【另见6.2c)】：组织宜新鲜运送到实验室，不得延误。标

本的选定部分应放在合适的冷冻介质中，冷冻在适合低温恒温仪器的专用支撑装置（例如金

属网格、底座、圆盘）上。应记录使用的冷冻介质。含有组织和冷冻介质的支撑装置宜冷冻

在液氮或干冰中，以保持形态。切割冷冻切片后，宜将剩余部分从支撑装置中取出而不解冻，

并贮存在预冷却的小瓶中以便长期贮存。

用冷冻培养基处理的样品宜贮存在-70℃以避免干燥，在使用每种冷冻介质处理样品前宜先评估

DNA的质量（参见6.6）。

在冷冻程序之前、期间和之后应执行以下步骤：

a)冷冻程序的记录（例如在液氮中冷冻，在液氮或干冰冷却的异戊烷中快速冷冻，在适当的冷

冻介质中冷冻，以受控制的冷却速率冷冻）；

b)冷冻时间点和日期的记录（以确定滞后时间：从身体移除之间的时间段-直到标本或样品冷

冻）；

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c)于低温贮存的冷冻容器：

1)冷冻容器应具有足够的体积以适应保存的标本或样品的大小；

2)冷冻容器应经过贮存温度认证；

3)冷冻容器应安全密封，最好用螺帽固定;不得使用带翻盖的容器；

注：由于密封不正确，当容器存放在液氮中时，管内液氮发生泄漏时，容器能在标本或样品回收时爆炸。

d)确定样品所需的组织尺寸是否适合冷冻前选定的低温小瓶，因为组织大小决定了容器的大小;

因此，建议标本/样品在一个维度上不超过1厘米；

e)标签应适合各自的冷冻贮存条件；

注：合适的标签[例如自粘标签、手写、射频识别（RFID）、预先标记的容器]应通过质量验证。

f)容器的标签应确保标本和样品的适当可追溯性。因此，容器标签应提供以下最基本信息：

1)标本供者/患者的ID，标本/样品唯一ID和采集标本和/或样品的日期，所有这些都能是编

码形式（每个标本/样品都是唯一的）；

2)组织类型，组织和疾病状况影响（例如肿瘤）或未受影响，除非样品跟踪系统能将这些

信息与6.3f）1）中使用的标本或样品的识别信息相匹配；

3)每个容器的唯一编号，能括在6.3f）1）中。

g)标本或样品的类型，数量和描述的文件

宜考虑在某些疾病状态下（例如肿瘤），分子特征可不均匀地存于组织标本中。因此，由具有资质

的病理医师对分子检验实际使用的组织样品进行评估是非常重要的。在这种情况下，宜记录用于分子检

验的组织标本所反映的疾病特征（例如：不同的分子机制可能在肿瘤的中心或浸润前沿被激活，肿瘤也

可能由不同分化等级的区域组成）。

6.4贮存要求

恒温应≤-70℃。宜用监测温度的系统。

冷冻机或液氮罐应具有温度报警系统。

在取回标本或样品期间可能发生严重的温度变化。因此，检索时间宜尽可能短，以避免样品解冻。

应记录能使待处理或进一步贮存的标本或样品解冻的偶然发生的温度变化。

宜供备用低温贮存设施。

应记录从贮存系统中取出任何标本或样品的贮存位置、贮存温度、时间和日期。

6.5DNA的分离

6.5.1总则

应根据国际公认的组织病理学分类（例如参考文献[15]）对标本或样品的细胞组成和疾病状况进行组

织病理学诊断（例如在苏木精/伊红（H＆E）切片上）。当标本或样品用于体外分子诊断的时候，在DNA

分离之前应根据检验要求确定靶细胞的比例。靶细胞的数量应足以进行检验。当标本或样品不用于分子

体外诊断时，例如用于研究，建议采用类似的方法。

a)所有能接触样品或组织载玻片的材料，包括裂解缓冲液和含有该缓冲液的小瓶，用于操作冷

冻样品进行冷冻切片或转移至裂解缓冲液的小瓶和工具应清洁且无核酸酶。在使用前，所有

材料（不包括裂解缓冲液和含有此缓冲液的小瓶）和用于操作冷冻样品进行冷冻切片并转移

至裂解缓冲液的工具应冷却至＜0℃。处理材料和/或冷冻样品的人员应戴手套。在切割每个冷

冻组织标本/样品后，应根据制造商的说明用核酸清除剂清洁切片机的相关部分，包括可重复

使用的刀片。宜考虑在切片机上使用新的一次性刀片以避免交叉污染；

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

b)形态学变化（例如肿瘤含量），可能影响检查结果；冷冻切片宜用于DNA分离，并通过每隔

50μm切割切片进行苏木精和伊红（H&E）染色来检查形态学。

c)应记录所使用的方法以及过程中使用的试剂盒和批号；

提取的DNA宜保存在冰上或2℃至8℃（例如冷冻头），并宜立即检测或长期贮存；

为避免DNA检验中扩增材料的交叉污染，DNA的分离不宜与检验过程的扩增步骤在同一区域

进行，除非使用封闭系统，以避免交叉-污染。

如果对标本或样品的正确识别存在疑问，则应验证标本/样品的身份，例如在人类身份检测中使用

的方法，如短串联重复（STR）分析。

DNA的分离是诊断工作流程中的关键步骤，在整个工作流程的验证过程中应特别关注。

宜在DNA能力检测程序中检测DNA分离性能。

6.5.2使用商品化试剂盒

当使用专用于从冷冻组织中分离DNA的商品试剂盒时，应遵循制造商的使用说明。

6.5.3使用实验室自建程序

如果在商品化试剂盒的基础上开发新的方法具有新的用途，经确认符合用户自定义的用途，应制定

说明并遵守。

如果实验室使用不同于商品试剂盒的自建程序，则应确认证明它符合目的，应编写说明并遵守。

使用不同制造商的产品能影响结果，因为产品不必兼容。只有在组件经过配套测试并通过预期检验

验证时，它们才宜应用于诊断测试。

实验室开发的冷冻组织切片DNA分离程序宜包含以下步骤：

a)组织切片在裂解缓冲液中重悬。

b)用蛋白酶K消化去除蛋白质，并从较大的切片或片段中释放DNA。对于蛋白酶K消化步骤（例

如在55℃至56℃进行），宜优化裂解缓冲液，然后进行蛋白酶K热灭活步骤，例如在95℃进行。

注:有些商业试剂盒和实验室开发的蛋白酶K方案可用于从同一组织中依次分离RNA和DNA。这种方

案往往会导致一些DNA损失并将DNA带入到RNA提取过程中，并可能影响从一定量组织中提取的预期

DNA产量。

c)可选方案：如需要无RNA的基因组DNA，则与RNaseA一起孵育。

注1：当使用实验室开发的方法时，过量的RNA可能会与DNA共纯化，从而可能干扰预期的检验。

在这种情况下，可能需要加入RNase消化步骤。

注2：即使在消化后，如果消化的RNA片段在DNA纯化过程中未被充分去除，共纯化的RNA可能会

导致通过分光光度法的DNA产量的过定量。这种过定量和实际存在的RNA也可能干扰检验。

d)从裂解液中分离DNA，例如使用苯酚/氯仿法，或者使用适用于从冷冻组织中纯化DNA的商业

试剂盒。

13

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

6.6DNA分离DNA的定性和定量评估

宜根据诊断试剂盒制造商的说明检测DNA的数量和质量，或者通过普遍接受的物理、化学和生物

化学程序进行检测。ISO20395为DNA质量和数量测量确认提供了更具体的指导。根据具体的检验，程

序可包括以下一种或多种技术：

a)通过吸光度测量（A260）、荧光分光光度法或基因组特异性qPCR法进行定量，参见文献[16]

和[17]

b)通过吸光度测量纯度（例如波长扫描，A260/A280比值评估蛋白质污染，A260/A230比值来

评估酚、盐、酒精等污染）；

c)检测DNA完整性和扩增能力（通过电泳、色谱法或分子方法，例如差异长度扩增子比率）

[18][19]；

d)通过使用外源对照（掺入DNA对照）或检查异常的qPCR反应曲线来检测干扰物质的存在[20]。

注：对于定性检查，例如存在/缺失、测序、拷贝数变异，通常采用a)和6.6b)；对于定量检验，检查6.6a）至d）是

必需的。

6.7分离DNA的贮存

应按照检验制造商的说明贮存分离的DNA。如果没有这些说明，则应按照DNA分离试剂盒制造商

的说明进行操作。

在没有上述信息的情况下，实验室应使用自建的和经过验证的程序来贮存分离的DNA。

如果所提供的DNA分离试剂盒无法提供信息，或者实验室使用自建的DNA分离程序，则实验室应建立

和验证具体的存储分离的DNA的程序。

为了长期存储，DNA宜在弱碱性洗脱缓冲液中溶解，例如：TE缓冲液（10mMTris和1mMEDTA，

使用HCL将PH值调至适合DNA检验）。

注：根据DNA分离程序和所得洗脱液的质量，在某些情况下，在室温下短时间或在2°C至8℃下贮存可能是合适的。

通常长期存储应在-70°C或更低温度下进行。也能使用其他通过验证的贮存方法[21][22]。

宜使用适当的存储容器，如冷冻管。

通常宜避免多次冻融循环。为了长期存储，宜将DNA分成小份。任何DNA小份的解冻和重新冷冻

都应有记录。

对于长期贮存，宜有一个经过确认的程序来组织和唯一标记含有分离DNA或由其衍生的等分试样的

贮存容器。

应确保可追溯性，例如，通过使用可读取的RFID，1D或2D条形码或预先印制的贮存容器，其具有

适合于低温贮存的制造商提供的唯一编码。

14

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

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9

16

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

目次

前言II

...............................................................................................................................................

引言III

..............................................................................................................................................

1范围4

......................................................................................................................................................

2规范性引用文件4

....................................................................................................................................

3术语和定义4

...........................................................................................................................................

4总则8

......................................................................................................................................................

5实验室外部8

...........................................................................................................................................

6实验室内部10

.........................................................................................................................................

I

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第3部分：分离DNA

1范围

本文件提供了在进行分子分析之前的检验前阶段，用于DNA检验的冷冻组织标本的处理、记录、贮

存及取材的要求和建议。

本文件适用于医学实验室和分子病理实验室对冷冻组织中提取的蛋白质进行的分子体外诊断检验，

包含实验室自建检测。本文件也适用于实验室客户、体外诊断开发者和制造商、生物样本库、开展生物

医学研究的机构和商业组织、以及监管机构。

本文件不包括冷冻前经过化学稳定预处理的组织。

注：国际、国家或地区法规或要求同样能适用于本文件所涵盖的特定内容。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T22576.1-2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）

3术语和定义

ISO15189界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

ISO和IEC维护的用于标准化的术语数据库，地址如下：

——ISO在线浏览平台：可在/obp上获得。

——IEC电子百科：可在/上获得。

3.1

等分样品aliquot

假定取样误差忽略不计时，大量均质物质的一部分。

注1：该术语通常适用于液体。组织是异质的，所以不能等分。

注2：该定义源于第[22],[23],[24]条参考文献。

3.2

环境温度ambienttemperature

未经调节的周围空气的温度。

3.3

分析物analyte

4

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

被测量名称所代表的组分。

[来源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]

3.4

分析检测性能analyticaltestperformance

测量待测分析物的检验的准确度、精密度和灵敏度。

注：也能适用于其他试验性能特性，比如稳健性、重复性等。

3.5

生物样本库biobanking

获取和贮存生物材料以及相关信息和数据的过程，以及与采集、制备、保存、检测、分析和分发有

关的部分或全部活动。

3.6冷缺血coldischemia

组织自人体取出后至稳定或固定前的存在状况。

3.7

诊断diagnosis

从其体征和/或症状中识别健康或疾病状态，诊断过程能通过各种检验对个体状况进行分类，分成

不同的类别或亚类，以便做出关于治疗和预后的医学决策。

3.8

DNA

脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid

以双链或单链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合体。

[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2]

[来源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]

3.9

DNAase

脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease

催化DNA降解成更小组分的酶。

3.10

检验examination

分析检测analyticaltest

以确定一个特性的值或特征为目标的一组操作。

注：从分离的分析物开始、包括各种用于定性或定量检验的参数测试或化学操作的过程。

[来源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,删除原注1~3，补充新注，“分析检测”被添加为首选术

语。]

3.11

大体检查grossing,grossexamination

5

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

为获得诊断信息，在准备后续显微镜检查过程中对病理标本所做的肉眼检查。

3.12

均质homogeneous

结构和组成均匀

3.13

干扰物质interferingsubstances

能改变检验（3.10）结果的标本（3.18）/样品（3.17）中的内源性物质或外源性物质（如：稳定剂）。

3.14

检验前过程pre-examinationprocess

分析前阶段preanalyticalphase

分析前工作流程preanalyticalworkflow

按时间顺序从临床医生的申请开始，包括检验（3.10）申请、病人的准备和身份识别、原始样品（3.18