植物胚胎(胚乳)培养及离体授粉

6⚫影响花药/小孢子培养的关键因素

基因型、小孢子发育时期不同Brassica

napus基因型的小孢子产胚率GenotypeEmbryoid/10

microsporeSeedling

(%)Topas10000-2000001-20Westar1000-100000.1-1Delta100-100000.01-1Bounty10-1000.001-0.01⚫

供体植株的生理状态和环境条件(Physiological

status

of

donor

plant)光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，

幼龄比老龄植株易于培养。主茎易于侧(次)分枝⚫

培养基及培养条件单倍体植株的加倍方法

⚫自然加倍⚫人工加倍：化学药剂处理(有丝分裂抑制剂）原生质体定义指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞原生质体纯化方法Sedimentation(沉降法)Flotation(上浮法，用23%蔗糖)界面法6原生质体培养原生质体计数:

原生质体培养前必须调到一定密度,即确定每毫升培养基中

含多少原生质体.

用CPW13M悬浮原生质体,血球计数板计数,计算稀释倍数浓度：一般~10原生质体培养方法⚫

液体浅层培养(Liquid

thin

layer

culture):

将纯化后的原生质体悬浮于液体培养

基中,

再取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。⚫

固体培养(Solid

culture):

叫琼脂糖平板法(Agarose

plate

culture)或包埋培养法

(Embedding

culture)。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂(主要是琼脂或低熔

点琼脂糖，LMT

agarose)按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养⚫

固液双层培养法(Solid

over

liquid

culture):

此法结合液体浅层培养和固体培养的

优点，在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。

固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的

有毒物质可以被固体培养基吸收。◼

原生质体培养好坏的标准之一：植板率(Plating

efficiency)，

即形成愈伤组织的

原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比原生质体再生⚫

细胞壁再生:

原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培

养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已

经开始再生细胞壁。不同原生质体再生细胞壁时间：从几小时到几天。➢

细胞壁检测方法：荧光增白剂（Calcofouor

White，CFW),一种二苯乙烯

类化合物，非特异性荧光染料，能非特异性结合糖苷键连接多糖，如几丁

质、葡聚糖和纤维等，荧光显微镜下发出荧光。0h3h6h

12h18h

24h36h

36hCotton

protoplastsB、D、F、H、J、L

、N、P

CFW染色⚫

原生质体增殖：第一次分裂通常发生在培养后2-5天⚫

植株再生:

具有再生能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。当细胞团

进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织(Mini

callus)，及时转移到分化培养基

(Differentiation

medium)中培养原生质体融合原生质体融合(Protoplast

fusion):即细胞融合(Cell

fusion)，也叫体细胞杂交(Somatichybridization)，超性杂交(Parasexual

hybridization)或超性融合(Parasexual

fusion)。是指不同

种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。为了与有性杂

交区别开来，原生质体融合常常写作“a（+）b”，其中a和b是两个融合亲本，（+）

表示体细胞杂交。原生质体融合的意义⚫

克服有性杂交不亲和及生殖障碍原生质体融合不涉及到雌雄性配子，从而可以克服远缘杂交的生殖障碍。上世纪八十年代，有学者试图将番茄和马铃薯的原生质体融合，以图获得地上长番

茄地下结马铃薯的植株(即番茄薯或薯番茄)。Georg

Melchers教授等通过原生质体

融合获得此类植株，虽然这种植株没有太大的经济价值，但其设想具有深远的意义Pomato⚫

转移有利的农艺性状，创造新的种质材料作物栽培品种常常缺乏某些抗性性状，在栽培中处于不利地位。野生种中具有很

多优良的抗性，通过原生质体融合可以将野生种的抗性转移进栽培种中。⚫

转移胞质基因，为研究体细胞遗传提供途径和材料现有研究表明，植物的细胞质控制着很多优良的性状，如线粒体控制胞质雄性不

育，叶绿体控制的抗除草剂特性。由于有性杂交的胞质成分主要为母系遗传，不

可能实现杂交亲本的胞质杂交。但原生质体融合则可以达到此目的⚫

创造异附加系、代换系等遗传材料⚫

缩短育种年限，提高育种效率原生质体融合方法Protoplast

FusionSpontaneous

fusionIntraspecific

Intergeneric

ChemofusionNaNO3高pH-高钙法

PEG介导Induced

fusionElectrofusionMechanical

fusion电融合(Electrofusion）电融合仪的结构特点：一是高频交流电场部分；一是高频直流高压脉冲部分。主要是双向电泳法，其基本过程是：⚫

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原

生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使

原生质体紧密接触排列成串；⚫

膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从

而导致两个紧密接触的细胞融合在一起AC

DC

DC电融合三大优点：不存在细胞毒害问题；融合效率高；操作简便原生质体融合方式⚫

对称融合(Symmetric

fusion):亲本原生质体在融合前未进行处理（如辐射、碘

乙酰胺等）的一种融合方式。

由于它综合双亲的全部性状，在导入有利性状的

同时，也不可避免地带入不利性状。⚫

非对称融合(Asymmetric

fusion):

:

融合前，对一方原生质体进行射线照射处

理，钝化其细胞核，另一方原生质体不处理或经化学试剂（如碘乙酰胺、碘乙酸、

罗丹明6-G等）处理，前者通常称为供体（Donor），后者则称为受体

（Recipient），也称供-受体融合（Donor-recipient

fusion）。➢

供体处理:

目的主要是造成染色体的断裂和片段化(Fragmentation)，从而使供体

染色体进入到受体后部分或全部丢失，达到转移部分遗传物质或只转移细胞质➢

受体的处理

:

为了减少融合再生后代的筛选工作，研究者利用一些代谢抑制剂

（Metabolism

inhibitor）处理受体原生质体以抑制其分裂。常用的抑制剂有碘

乙酸（Iodoacetic

acid，IA）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IOA）和罗丹明6-

G（Rhodamin

6-G，R-6-G）。融合产物⚫

对称杂种（Symmetric

hybrid）指杂种中具有融合双亲全部的核遗传物质。

⚫

非对称杂种（Symmetric

hybrid）指双亲或其中一方的核遗传物质出现了丢失。

⚫

胞质杂种（Cybrid）是非对称杂种的一种，指融合一方的核物质完全丢失，并且具有双方的细胞质遗传物质。⚫

异质杂种（Alloplasmic

hybrid），指杂种的细胞核来源于一方，而细胞质来

自于另一方。体细胞杂种的筛选和鉴定⚫

杂种细胞选择➢

互补筛选法：利用双亲细胞在生理或遗传方面所产生的互补作用来筛选，如在

选择压力培养基上只有具有互补作用的体细胞才能生长发育。➢物理特性筛选法。常用的：可见标记物筛选法，如颜色差异；荧光素筛选法，向

亲本原生质体导入两种不同的荧光素等⚫

杂种植株选择➢

形态学鉴定：利用杂种植株和双亲在表型上的差异鉴定C201➢

细胞学鉴定Somatic

hybridsK➢

生物化学鉴定：如利用同工酶亲本2亲本1杂种Homoserine

dehydrogenase

activities

➢

分子生物学鉴定体细胞杂种的重要应用Fruits

from

allotetraploid

somatic

hybrids.

Left:

‘Valencia’

sweet

orange

+

‘Robinson’

9

x

‘Temple’;

Middle:

‘Nova’

+

‘Osceola’;

Right:

‘Rohde

Red

Valencia’

+

‘Dancy

’植物胚胎(胚乳)培养及离体授粉胚胎培养（Embryo

culture）:

指植物胚（种胚）及胚器官

（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术胚培养的意义⚫

克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性(杂种胚的败育

)，获得种间或属间杂种在很多种间和属间杂交中，受精作用能正常完成，胚也能进行早期的发育，但

由于胚乳发育不良，杂种胚最终将会夭折，因而不能形成有发芽能力的种子。Embryo

development

of

the

interspecific

hybrid

C.

martinezii

L.

(南瓜)×

C.

pepo

L

(西葫芦)

through

embryo

rescue

technique

A)

Embryo

at

excision

time;

B)

embryo

at

7

(B),14

(C)

and

30

days-old

(D)⚫

打破种子休眠，促进胚萌发及缩短育种周期植物休眠从几天到几年不等。某些园艺植物如落叶树的育种和繁育工作因种子休

眠期太长而受到影响。休眠的种子在合适的温度、氧气和湿度条件也不能萌发，

而应用胚培养常常可以克服这一类种子发育上的障碍，促进胚的生长发育。通过

胚的离体培养，缩短休眠期。苹果属的一些品种，种子播种后在土壤中需几个月才能萌发，离体培养的胚却能

在48h萌发，4周内形成移植幼苗，5个月的幼苗长达1

m高。红豆杉：自然条件下休眠期几年(a)

Zygotic

embryos

excised

from

mature

seed

and

cultured

on

WPMB5

with

0.5%

AC

basal

salt

medium,

after

2

(b)

3

(c)

and

4

weeks

(d)

of

culture.

Radical

emergence

at

the

end

of

5

weeks

(e)⚫

快速繁育特殊(稀有)植物胚—种子—幼苗百山祖冷杉植物界的大熊猫：百山祖冷杉外，银杉、华盖木、伯乐树、金花茶等园艺系陈利萍教授：胚—幼苗许多落叶果树的种子是早熟的,种子往往不育。用胚胎培养可以将不能正常

萌发的种子培养出第二代植物。兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6~7个细胞，多数胚不能成活。如在种子

接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植株。⚫

诱导胚性愈伤组织Wheat

immature

embryoMature

embryo⚫

获得单倍体植株单倍体的产生方法很多，通过远缘杂交，结合胚培养技术是获得单倍体的有

效方法之一。栽培大麦与球茎大麦进行杂交，受精作用几乎完全正常，但由

于二者的细胞分裂周期不同，合子胚在经过几次有丝分裂以后，球茎大麦的

染色体被淘汰，子细胞中只留下大麦的染色体，为大麦单倍体。⚫

种子活力测定对于休眠性强的种子？？？WT

hxk9TTC染色法都可染，发芽率100%？Seedling

emergence

and

germination

of

isolated

A.

crenata

(朱砂根)

embryosJournal

of

Botany

Volume

2012,

Article

ID

679765胚培养类型⚫

成熟胚培养：子叶期后至发育完全的胚

⚫

幼胚培养：子叶期以前具胚结构的胚胚培养操作过程取材和消毒胚的剥离接种(看护)培养离体(幼)胚发育途径⚫

胚胎发育途径(embryonic

development)⚫

胚性发育途径(embryonal

development)幼胚接种到培养基上以后,仍然按照在活体内的发育方式发育,最后形成成熟胚

(有时甚至可能类似种子),

然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株,这种途径发

育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株.⚫

早熟萌发途径(early

mature

sprouting)未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象，苗弱小。

⚫

产生愈伤途径幼胚、成熟胚遗传转化胚珠和子房培养Ovary

(授粉子房和未授粉子房）；Ovule（受精和未受精）胚珠培养的意义⚫

成熟胚很小时，胚培养难以成功，采用胚珠培养较易成功

。Maheshwari将

授粉5天的罂粟（Papaver

somnierum）胚珠进行离体培养，得到种子。

罂粟授粉5天的胚珠仅为合子胚或只有2个细胞的原胚

。⚫

对未受精的胚珠进行培养可诱发大孢子发育成单倍体植物

。⚫

在棉花种间杂交中，通过胚珠培养可以防止由于棉铃脱落丧失杂种胚。⚫

研究棉花的纤维发育Cucumber

Gynogenesis纤维如何发育棉花胚珠和纤维的发育过程开花当天棉花纤维细胞开始突起萌发，花后3天左右肉眼看见

伸长纤维细胞，5天左右纤维细胞已经伸长并包裹胚珠，5~10

天是纤维的快速伸长期，16天左右初生壁开始沉积，纤维细

胞的纤维素含量开始提高最终达到细胞质量的90%左右。Trichome

on

Arabidopsis

leaf

Pavement

cell,

stomata

(in

blue),and

fiber

cells

initiating

from

the

epidermis

of

cottonseed

epidermis棉花的胚珠培养未受精胚珠受精胚珠培养2天培养6天培养15天

纤维细胞显著伸长胚乳培养胚乳培养(endosperm

culture)：离体条件下以胚乳为外植体培养获得植株的技术原生质体再生的主要过程⚫

细胞壁再生:

原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培

养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已

经开始再生细胞壁。不同原生质体再生细胞壁时间：从几小时到几天。⚫

原生质体增殖：第一次分裂通常发生在培养后2-5天⚫

植株再生:

具有再生能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。当细胞团

进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织(Mini

callus)，及时转移到分化培养基

(Differentiation

medium)中培养原生质体融合方法原生质体融合方式⚫

对称融合(Symmetric

fusion):亲本原生质体在融合前未进行处理（如辐射、碘

乙酰胺等）的一种融合方式。

由于它综合双亲的全部性状，在导入有利性状的

同时，也不可避免地带入不利性状。⚫

非对称融合(Asymmetric

fusion):

:

融合前，对一方原生质体进行射线照射处

理，钝化其细胞核，另一方原生质体不处理或经化学试剂（如碘乙酰胺、碘乙酸、

罗丹明6-G等）处理，前者通常称为供体（Donor），后者则称为受体

（Recipient），也称供-受体融合（Donor-recipient

fusion）。离体胚培养类型及其发育途径⚫

成熟胚培养：子叶期后至发育完全的胚

⚫

幼胚培养：子叶期以前具胚结构的胚发育途径⚫

胚胎发育途径(embryonic

development)

⚫

胚性发育途径(embryonal

development)

⚫

早熟萌发途径(early

mature

sprouting)

⚫

产生愈伤途径胚乳培养的意义⚫

自然条件下，胚乳细胞以淀粉、蛋白质和脂类的形式贮存着大量的营养

物质，以供胚胎发育和种子萌发之需。胚乳是研究这些天然产物代谢过

程的一个理想系统。⚫获得三倍体重要途径(无籽果实、6倍体等应用）⚫胚乳植株染色体的不稳定性，为染色体工程研究提供有效途径Triploid

plants

from

endosperm

callus

of

neem,

Azadirachta

indica

A.Juss

（印楝）植物离体授粉In

vivo植物离体授粉(In

vitro

pollination):

也叫立体受精(in

vitro

fertilization)

，指在人工控制条件下使离体的胚珠或子房完成授粉、受精形成果实或种子的过程Pollen

germination受精障碍⚫

花粉在柱头上不能萌发

⚫

花粉管不能进入胚珠

⚫

花粉在花柱中破裂离体授粉的意义⚫

克服杂交不亲和性(远缘杂交不亲和、自交不亲和)甘蓝X白菜

离体授粉A:

甘蓝子房内白菜花粉粒萌发（24h）；授粉48h(B)，72h(C)，5d(D)

⚫

诱导孤雌生殖⚫

双受精及胚胎早期发育机理研究第六章

植物体细胞无性系变异及应用体细胞无性系变异(Somaclonal

variation):

泛指在植物细胞、组织或器官离体培养过程中，受到非生物因子诱导，进而导致培养细

胞和再生植株发生遗传变异(genetic

variation)或表观遗传变异

(epigenetic

variation).⚫

遗传变异(genetic

variation):

基因重组、基因突变和染色体变异

⚫

表观遗传变异(epigenetic

variation)

：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、转座子激活和基因沉默等体细胞无性系变异的性状表现

⚫

农艺性状的变异Leaf

morphology

of

the

wildtype

(WT)

and

ten

somaclonalvariant

types

(SVT)

of

‘Red

Flash’

caladium

(花叶芋)Plant

Cell

Tiss

Organ

Cult

(2016)

126:269

–279⚫

(次生)代谢物成分及含量变异Oil

content

of

soybean

seed

produced

by

individual

R1

plants

grown

in

the

field

in

1993Theor

Appl

Genet

(2001)

102:1072

–1075⚫

染色体数目及结构的变异In

Vitro

Cell.Dev.Biol.

—Plant

(2015)

51:350

–359Autotetraploid

plant

regeneration

by

indirect

somatic

embryogenesis

from

leaf

mesophyll

protoplasts

of

diploid

Gentiana

decumbens

L.f⚫

DNA结构的变异体细胞无性变异系得遗传学原理

⚫

体细胞无性系的细胞学变异➢

染色体数目变异Autotetraploid

plant

regeneration

by

indirect

somatic

embryogenesis

from

leaf

mesophyll

protoplasts

of

diploid

Gentiana

decumbens

L.f➢

染色体结构变异⚫

体细胞无性系的DNA水平变异

➢

基因突变➢

基因的扩增和丢失再生芽和植株(T.

durum)

and

CMS

(T.

timopheevi)Theor

Appl

Genet

(1996)

93:355-360Lane

a:

T.

durum

cytoplasm,

lane

c:

T.

timopheevi

cytoplasm,

lane

b:regenerated

triticle

shoots

of

cross

number

745

(T.

durum

cytoplasm)Theor

Appl

Genet

(1996)

93:355-360➢

表观遗传变化Schematic

illustration

of

changes

in

chromatin

structure

via

DNA

methylation,

histone

modification,

and

small

RNA-directed

DNA

methylation

(RdDM)Journal

of

Experimental

Botany,

62

：

3713–

3725,

2011➢

DNA甲基化变化Analysis

of

DNA

methylation

in

plant

in

vitro

cultures

for

assessment

of

somaclonal

variationHPCE,

high

performance

capillary

electrophoresis;

HPLC,

high

performance

liquidchromatography;

MS,

methylation-sensitive;

SssI-MAA,

SssI-methylase

accepting

assayJournal

of

Experimental

Botany,

62

：

3713–

3725,

2011➢

组蛋白及小RNA的变化Modifications

in

histones

and

small

RNA

levels

detected

in

plant

cells/tissues

cultured

in

vitr

oJournal

of

Experimental

Botany,

62

：

3713

–3725,

2011➢

转座子激活Diagram

of

the

of

the

TCUP

sequence

DQ324364.1

drawn

to

scaleThe

DNA

sequence

of

the

predicted

hAT

transposase

ORF

is

represented

as

a

gray

box,

the

Znf-BED

domain

is

represent

by

a

blue

box,

and

the

hATC

domain

is

represent

with

a

red

boxFront

Plant

Sci.

2012,

3:6.➢

转座子激活Diagram

of

the

experimental

design

used

for

the

25-

μM

5-aza-2-deoxycytosine

treatment

experimentsTreat

UntreatRT-PCR

demonstrating

multiple

TCUP

transcripts

present

in

azadC

treated

callus

P,

Hi-II

A×B

seedling;

B,

BMS

callus.Front

Plant

Sci.

2012,

3:6.➢

细胞器DNA的变化（叶绿体或线粒体）再生芽和植株(T.

durum)

and

CMS

(T.

timopheevi)Theor

Appl

Genet

(1996)

93:355-360Lane

a:

T.

durum

cytoplasm,

lane

c:

T.

timopheevi

cytoplasm,

lane

b:regenerated

triticle

shoots

of

cross

number

745

(T.

durum

cytoplasm)Theor

Appl

Genet

(1996)

93:355-360➢

基因沉默(部分也表现为表观遗传)Cassava

mosaic

disease

(CMD)

and

cassava

brown

streak

disease

(CBSD)：

非洲木薯生产中最重要的两种病毒；CMD的抗