全血胆碱酯酶（CHE）活力测定

全血胆碱酯酶（CHE）活力测定中山大学公共卫生学院824办公室冯玉超

有机磷酸酯农药是我国目前生产和使用最多的一类农药。

对硫磷、内吸磷、马拉硫磷、乐果、敌百虫及敌敌畏Q:有机磷中毒机制及临床表现？有机磷中毒机制及临床表现抑制体内胆碱酯酶（ChE）活性乙酰胆碱胆碱酯酶有机磷农药2、烟碱样症状（N受体）1、毒蕈碱样症状（M受体）3、中枢神经系统症状头晕、乏力、意识障碍腺体分泌亢进：多汗、口鼻分泌物增多平滑肌痉挛：呼吸困难、恶心呕吐、腹泻瞳孔缩小血压升高、心动过速运动神经兴奋：肌肉震颤、痉挛、无力观察小鼠染毒后10min的表现

乙酰胆碱酯酶，主要分布于神经系统及红细胞表面，具有水解乙酰胆碱的特殊功能。全血或红细胞胆碱酯酶活力测定是有机磷农药急性中毒分级和慢性中毒的诊断指标。

全血胆碱酶活性范围：（GBZ8-2002)接触反应：全血或红细胞胆碱酯酶活力<70%,无明显临床症状；

或全血或红细胞胆碱酯酶活力>70%，有轻度毒蕈碱样

自主神经症状或中枢神经系统症状。有机磷农药急性中毒的分级诊断标准急性轻度中毒50%~70%急性中度中毒30%~50%急性重度中毒<30%结合相应临床症状一、实验目的3、加深对有机磷农药中毒机制的理解。1、掌握全血胆碱酯酶活力的测定原理及方法。2、了解胆碱酯酶活性测定在职业有机磷中毒诊断中的意义及应用。二、实验原理

乙酰胆碱胆碱酯酶胆碱乙酸碱性羟胺乙酰羟胺羟肟酸铁（棕红色络合物）FeCl3HCl吸光度值越大，血液中剩余乙酰胆碱的量越多，胆碱酯酶活性越低实验试剂及器材

试剂：0.5mg/ml敌敌畏溶液、肝素钠溶液、蒸馏水、

胆碱酯酶活性测定试剂盒器材：分光光度计、水浴锅、离心机、微量移液器、1ml注射器、剪刀、1.5mlEP管、15毫升离心管

试剂瓶三、实验步骤和方法

1、染毒及血样的采集和制备2、实验试剂的配置3、反应体系的配置4、样品的检测5、结果的分析

1、染毒及血样的采集和制备实验动物：小鼠

毒物：敌敌畏染毒剂量：0.1ml/10g

敌敌畏溶液染毒方式：腹腔注射染毒时间：10分钟

血样的采集和制备①尾静脉采血

轻弹小鼠尾巴，酒精棉球消毒，剪尾0.5cm,向尾末端挤压。②采血时间：染毒前后各采血一次，按下述方法制备血样标本（取血---染毒---取血）保证染毒前后采血量一致（4滴），采完止血。③血样标本制备：先用肝素钠润洗EP管，取25ul的肝素钠溶液置于1.5mlEP管管口，①获得的血与肝素钠溶液混匀，以获得50ul的血、肝素钠混匀液；取50ul血、肝素钠混匀液与200ul的冷却蒸馏水混匀，室温静置15分钟，待血液澄清透亮，以备用。

2、实验试剂的配制按照胆碱酯酶活性测定试剂盒说明配置以下溶液：①8µmol/ml乙酰胆碱应用液；乙酰胆碱粉剂（-20℃，离心）加入到试剂二稀释液，混匀后所得混合液与试剂一按1:9的比例配。（3ml混合液+27ml试剂一）

②碱性羟胺（试剂三应用液)；试剂三乙液加入到试剂三甲粉剂，混匀后所得试剂与试剂三丙液按1:1配成。

（10ml甲乙混合液+10ml丙液）③FeCl3

溶液（试剂六）；试剂六溶液直接加入到试剂六粉剂。注：上述应用液均需现配现用，试剂一、试剂四、试剂五不用配。

测定管对照管空白管待测样本（ml)（胆碱酯酶）0.1--蒸馏水（ml）--0.358umol/ml乙酰胆碱应用液（ml)0.250.25-试剂一（ml）（磷酸盐缓冲液）0.50.50.5混匀，37℃水浴20分钟试剂三应用液（ml）（碱性羟胺）1.01.01.0试剂四（ml）0.50.50.5试剂五（ml）（盐酸）0.250.250.25试剂六（ml）（FeCl3)0.50.50.5待测样本（ml）-0.1-准备5个15ml离心管染毒前：测定管、对照管染毒后：测定管、对照管空白管3、反应体系的配制胆碱酯酶水解乙酰胆碱剩余乙酰胆碱与羟胺及铁离子反应

4.样品的检测1.将上述反应溶液混匀，3000~3500转/分，离心10分钟；（棕红色的上清溶液）2.分光光度计用空白管调零，取上清，于520nm测各管吸光度值。

5.结果的计算和分析计算全血胆碱酯酶活力胆碱酯酶活力：每毫升全血在37℃和底物作用20分钟，

分解1µmol乙酰胆碱为一个活性单位。计算CHE活力相对值d=染毒后CHE活力/染毒前CHE活力根据胆碱酯酶活力相对值对模型中毒情况进行评价

四、注意事项

正确完成腹腔注射及尾静脉取血的基本操作，以保证获得足够的样本进行实验；取出的血滴应及时与肝素钠溶液混匀，避免血液凝块的形成；血样标本制备完成后（血液澄清透亮），应立即与乙酰胆碱反应，防止胆碱酯酶的失活；配制反应体系时注意严格按照顺序加入各试剂；正确使用分光光度仪进行结果的检测（加三氯化铁显色后，在20min内比色，调零、上清、比色皿）；注意实验室安全，自身物品远离实验台，防止敌敌畏的误食、吸入或污染皮肤；实验报告要求1、实验目的及意义2、实验方法：简单叙述操作步骤3、结果分析a.计算染毒前后全血CHE的活力及其比值；b.根据GBZ8-2002诊断标准，初步诊断该模型有机磷农药中毒的情况；c.分析影响实验成败的因素。实验流程称重采血血样制备配置反应体系