第四章 DNA的复制课件7

第四章DNA的复制第一节DNA复制概述第二节原核生物DNA的复制第三节真核生物DNA的复制

第四章DNA的复制(4)DNA复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。第四章DNA的复制(4)生物体内遗传信息的传递复制DNA是遗传信息的载体，生物体要保持物种的延续，子代必须从亲代继承控制个体发育的遗传信息。生物体通过细胞分裂来实现物种的传递和个体数目的增殖，在此过程中细胞染色体的数目加倍，作为遗传物质的DNA分子的数目也加倍(复制)，并伴随染色体平均分配到两个子代细胞中。第四章DNA的复制(4)第一节DNA复制概述一、半保留复制二、DNA复制的一些概念三、DNA的半不连续复制四、DNA复制的酶体系五，DNA复制的高保真性第四章DNA的复制(4)一、半保留复制

DNA复制过程中，新合成的两个子代DNA分子中，一条链是新合成的，另外一条链来自亲代，即子代细胞中只有一半的遗传物质来自亲代，这种复制方式称为半保留复制。

复制亲代DNA子代DNA第四章DNA的复制(4)半保留复制机理证明1958，Meselson，Stahl15N

14NCsCl密度梯度离心

半保留复制机理说明了DNA在代谢上的稳定性第四章DNA的复制(4)二、DNA复制的一些概念◎复制子（replicon）:基因组中控制DNA复制的复制单位。它包括控制复制开始的复制起点和终止复制的终止子。

所有的原核生物的染色体、噬菌体仅有一个复制子；真核生物的染色体有多个复制子，哺乳动物细胞含有50000-100000个，每个复制子约长50-200kb。第四章DNA的复制(4)

原核生物：一个复制起始位点。E.coli：oriC，全长245bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。真核生物：DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。

第四章DNA的复制(4)◎复制起点和终点无论是原核细胞还是真核细胞，复制都是从DNA分子上的特定位点开始的,这一位点称为复制起始点(origin)。而终止复制的位点称为复制终点(termini)。第四章DNA的复制(4)◎复制叉(replicationfork):复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。第四章DNA的复制(4)

◎复制方向

复制可以单向﹑双向进行，取决于在复制起始点有一个还是两个复制叉。通过放射自显影实验可以判断DNA复制是双向还是单向进行的。

从复制叉走势上看，有三种复制方式适合半保留复制机：相向复制单向复制双向复制第四章DNA的复制(4)相向复制:

从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。某些线性DNA病毒以这种方式进行复制，如：腺病毒。第四章DNA的复制(4)单向复制:

复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。

质粒colE1是个典型的例子第四章DNA的复制(4)双向复制:

从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡，用电子显微镜可以观察到复制泡的存在。原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式第四章DNA的复制(4)◎复制方式有三种θ型复制滚环复制D环复制第四章DNA的复制(4)θ型复制细菌常见的复制方式；双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，复制的中间产物为θ型结构，形状像希腊字母θθ型复制可以是双向或单向，大多为等速的双向，少数为不等速的双向复制单向双向◎复制方式三种θ型复制滚环复制D环复制第四章DNA的复制(4)第四章DNA的复制(4)3’-OH5’-P53535’5’5’3’3’3’3’5’滚环复制

指一些简单低等生物或染色体以外的DNA采取的特殊复制形式。如

X174和M13噬菌体等。环状DNA复制时,双链一股先打开一个缺口,5′端向外伸展,在伸展出的单链上进行不连续复制;没有开环的一股则可以一边滚动,一边进行连续复制.两股链均直接作为模板,不需要引物.第四章DNA的复制(4)dNTPDNA-polγ

特点:

复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。左：第一个引物在第一起始点上合成右：延长至第二起始点，合成第二引物最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制是线粒体DNA(mtDNA)的复制形式。复制时需合成引物。第四章DNA的复制(4)◎复制速度

真核生物其复制叉移动速度为1000-3000bp/min，细菌DNA复制叉的移动速度为50,000bp/min.真核生物基因组比原核生物大，染色体结构复杂，复制时需要解开核小体，之后又需重新形成核小体，真核生物染色体DNA上有许多复制起点，可分段复制真核生物染色体在全部复制完成之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。第四章DNA的复制(4)表

细菌和真核生物复制的比较生物复制子数复制子长度复制速率细菌（E.coli）14,200Kb50Kb/min酵母（S.cerevisiae）50040Kb3.6Kb/min果蝇（D.melanogaster）3,50040Kb2.6Kb/min爪蟾（X.laevis）15,000200Kb500bp/min小鼠（M.musculus）25,000150Kb2.2Kb/min植物（V.faba）35,000300Kb

作业:1名词解释:半保留复制复制子复制叉

2DNA复制方式有几种?各有如何特点?第四章DNA的复制(4)三、DNA复制的酶体系

DNA分子复制是通过DNA聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子的协同有序工作完成的。

复制体(Replisome):DNA复制是一个非常复杂的酶学过程,它需要30种以上的酶和蛋白质,人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系,其中一部分酶和蛋白质结合在一起,协同动作,构成复制体。第四章DNA的复制(4)DNA聚合酶DNA连接酶解旋酶单链结合蛋白引物酶DNA拓扑异构酶第四章DNA的复制(4)◆

DNA聚合酶(DNApolymerase)

n1dATP＋n2dGTP＋n3dCTP＋n4dTTP＋DNAdAMP＋dAMP＋dAMP＋dAMPMg2+DNA聚合酶+DNA+nPP1N聚合酶反应式DNA聚合酶反应特点☆以4种dNTP作为底物☆反应需要接受模板指导☆链延伸需要引物3‘-羟基存在☆链延伸方向5’3’☆

产物DNA极性与模板相对都是脱氧核糖核苷酸

第四章DNA的复制(4)如E.ColiDNA聚合酶☆DNA聚合酶I（PolI）☆

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）☆

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）第四章DNA的复制(4)323个氨基酸小片段35KD5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

68KD604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA聚合酶I

(PolI)Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

多功能酶PolI在复制过程中主要起修复损伤，校对的功能第四章DNA的复制(4)第四章DNA的复制(4)

此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。该酶的催化特性如下：聚合作用:该酶催化DNA的聚合，对模板有特殊要求。最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，且该单链空隙长不到100个核苷酸。对长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但用单链结合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可达原来的50-100倍。该酶也具有3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。该酶不是复制的主要聚合酶，因此酶缺陷的大肠杆菌突变株DNA复制都正常。可能在DNA损伤修复中起到一定的作用。DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）第四章DNA的复制(4)

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有1000个酶分子，催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/分/酶分子。这也证明DNA

polⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。第四章DNA的复制(4)（a）核心酶：（

,,）（b）β二聚体：保持全酶结合在DNA模板上（c）γ复合物：帮助β二聚体结合在模板上（d）τ二聚体：连接核心酶与γ复合物第四章DNA的复制(4)大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶性质的比较

聚合酶I聚合酶II聚合酶III5'→3'多聚酶√√√3'→5'外切酶√√√5'→3'外切酶√××结构多肽多肽多亚基复合物分子量109kD90kD900kD基因polApolBDNAE,DNAN,DNAQ,DNAX和其他未知亚基功能基本的修复、聚合酶和引物切除错误倾向修复聚合酶(SOS诱导)基本的复制聚合酶第四章DNA的复制(4)◆DNA连接酶催化双链DNA切口处的3′-OH和5′-P生成磷酸二酯键，完成链与链之间的连接ATP或NAD供应能量第四章DNA的复制(4)

解旋酶是一类解开氢键的酶，由ATP来供给能量。它常常依赖于单链的存在，并识别复制叉的单链结构。目前，大肠杆菌中发现有两类解旋酶参与这个过程，一类称为解旋酶Ⅱ或解旋酶Ⅲ，与模板DNA结合沿5‘→3’方向运动;第二类称为Rep蛋白，和模板DNA结合沿3'→5'方向运动。

◆解旋酶第四章DNA的复制(4)◆单链结合蛋白(SSB)

螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。避免单链退活形成链内氢键及保护单链不被降解SSB与DNA结合时无序列专一性；SSB可加强单链DNA对DNA聚合酶的亲和力；可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，并被重复利用。第四章DNA的复制(4)

DNA在细胞内常以超螺旋状态存在，DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类，拓扑异构酶Ⅰ.

作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，再将切断的单链DNA连接起来，不需要任何辅助因子。拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶(DNAgyrase))，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。

◆

DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase)第四章DNA的复制(4)DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，前导链DNA聚合开始，随从链DNA的合成也随着。前导链的合成是连续进行的，起始相对简单，而随从链的合成不连续，所以引发阶段比较复杂。

引物酶:

特殊的RNA聚合酶，催化短片段RNA的合成。短RNA片段十几至数十个核苷酸不等，它在DNA复制起始处做引物。RNA引物的3′-OH末端供DNA聚合酶催化形成DNA分子的第一个磷酸二酯键的位置。

引发体:高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶合成RNA引物，在引物RNA的3′-OH末端再合成DNA片段，因此随从链是不连续合成的开始。◆引发体的形成第四章DNA的复制(4)四、DNA的半不连续复制

DNA在复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链合成是不连续的，这样的复制过程称为半不连续合成。第四章DNA的复制(4)半不连续复制相关概念冈崎片段（Okazakifragment）

：DNA复制时，不连续合成的亲代单链（5′→3′）先合成小的DNA片段，再连接称完整的链，这些片段由冈崎等人发现，称为冈崎片段。前导链

(leadingstrand)：以复制叉向前移动的方向为标准，3′→5′方向的模板链其上DNA以5′→3′方向连续合成，称为前导链。后随链(laggingstrand)：复制叉移动方向相反，随着复制叉的移动，形成许多不连续的冈崎片段，最后连接成一条完整的DNA链，称为后随链。第四章DNA的复制(4)第四章DNA的复制(4)五，DNA复制的高保真性

为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。保真性主要与下列因素有关：遵守严格的碱基配对规律；

DNA聚合酶对底物的选择作用；对复制过程中出现的错误及时进行校正。

第四章DNA的复制(4)

第二节原核生物的DNA复制

以大肠杆菌染色体DNA的复制为例.复制过程分为3个阶段：起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同，DNA复制的阶段表现在其复制体结构的变化上153页第四章DNA的复制(4)一、大肠杆菌染色体DNA复制的起始◎复制起始区的DNA结构特点：全长245bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关含有多个回文结构（9－14个GATC，E.coli含有11个）8个GATC较保守，CATC中的“A”已甲基化。具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；第四章DNA的复制(4)

◎

DNA复制的起始

●DnaA单体首先结合到oriC

的4个含9bp的重复顺序上。

●

20～40个DnaA单体结合到oriC上形成一个核心。

●在DnaA蛋白的作用下，位于oriC右侧的3个含13bp的重复顺序开始解链形成开放复合体。

●

DnaB和DnaC蛋白形成一个复合体。在引发体中，每个DnaB六聚体结合6个DnaC单体,形成480Kd，直径为6nm的球状复合体。

●

DnaB提供解旋酶（helicase）活性，使DNA解旋形成复制叉。

DnaB还具有激活DnaG引发酶的能力第四章DNA的复制(4)●

DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA●引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装第四章DNA的复制(4)

表在oriC上前引发所需的蛋白蛋白

功能对蛋白质的要求DnaA协同结合于9bp和13bp重复顺序20-40单体DnaB结合于DnaA，提供解旋酶活性1-2六聚体DnaC和DnaB形成复合体六个单体HU组蛋白样蛋白，激发复合体形成～5个双体ssB(F)稳定单链化学剂量，四聚体第四章DNA的复制(4)二、大肠杆菌染色体DNA复制的延伸前导链的合成方向与复制叉运动的方向一致，因此只需要一次引发事件，PolⅢ全酶就能连续不断地延伸前导链。后随链合成方向与复制叉的运动方向相反，因此后随链的延伸是一个不连续的过程，需要重复不断地合成RNA引物，再通过PolⅢ全酶延伸成短的冈崎片段。在复制延伸阶段，同时进行前导链和后随链的合成第四章DNA的复制(4)

复制体（replisome）是由解旋酶、引发酶和DNAPolⅢ全酶组成的复合体。DNA合成时，沿着复制叉的方向移动。回环模型

DNA合成时，沿着复制叉的方向移动。后随链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。此模型称回环模型。第四章DNA的复制(4)

两个催化核心分别和DNA的两条模板链结合，全酶延着前导链模板随着复制叉的移动而移动，而后随链模板从复制体上“拉出”一段，形成一个环。DnaB产生了解链点，并沿着后随链以其5′→3′方向移动。第四章DNA的复制(4)当polⅢ全酶在DNA遇到一个裂口时核心复合体和滑动的“夹子”离开，然后在别的地方再和新的β亚基结合。在冈崎片段末端发生这种反应：当核心酶合成完一段冈崎片段时，核心复合体就会和模板解离，将环释放出来，另一个（也可能是同一个）核心复合体再和一个β夹子结合，起始下一个冈崎片段的合成。

冈崎片段上的引物要被切除，这样会形成一个空缺，由PolⅠ合成短片段DNA来填补这个空缺，再由连接酶完成连接任务第四章DNA的复制(4)回环模型的生物学意义前导链和后随链的协同合成对于生存是必须的，在DNA合成时遇到一个损伤位点将导致一条链合成停止，此时如果另一条链的合成不能相应停止，会造成更大的危害。第四章DNA的复制(4)三、大肠杆菌染色体DNA复制的终止复制叉相遇

复制叉2复制起点复制叉1

图11-33E.coli复制终止区(引自B.Lewin:GENESⅦ,2000,Fig.

12-7)

大肠杆菌染色体的终止区域含有两对反向重复顺序（terE,D,A和terC,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终点对复制叉移动的方向是特异的，它们这样排列是为了使复制叉能通过另一个终点而延伸。终止需要tus

基因的产物结合蛋白Tus(36kD)，它能识别ter保守顺序，ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶活性来阻止复制叉前进而实行终止。

第四章DNA的复制(4)基因座产物功能dnaE多聚酶III全酶的α亚基DNA聚合和校对dnaG引发酶，单体起始冈崎片段，合成RNAdnaN多聚酶III全酶的β亚基链的延伸dnaQ多聚酶III全酶的ε亚基校对功能dnaTi蛋白，引发体成分参与前引发danZX多聚酶III全酶的γ亚基形成γ复合体danZX多聚酶III全酶的τ亚基使核心酶形成二聚体gyrADNA回旋酶亚基α解除正超螺旋，引入负超螺旋gyrBDNA回旋酶亚基β解除正超螺旋，引入负超螺旋ligDNA连接酶，单体封闭冈崎片段之间的裂隙ori复制起点与dnaA，dnaB，dnaC结合，形成复制起始复合体polADNA聚合酶I修复，切除引物并填补冈崎片段间的空隙rnhARNaseH降解引物ssb单链结合蛋白使DNA单链保持稳定，暂不形成双链PriA解旋酶（3′→5′）位点识别，（一个分子/复制叉）取代SSBPriB引发体成分参与前引发PriC引发参与前引发ter复制终止区供终止蛋白识别、结合，终止复制tus终止蛋白识别、结合复制终止区，终止复制第四章DNA的复制(4)第三节真核生物DNA的复制表

真核生物复制生物复制子数复制子长度复制速率细菌（E.coli）14,200Kb50Kb/min酵母（S.cerevisiae）50040Kb3.6Kb/min果蝇（D.melanogaster）3,50040Kb2.6Kb/min爪蟾（X.laevis）15,000200Kb500bp/min小鼠（M.musculus）25,000150Kb2.2Kb/min植物（V.faba）35,000300Kb

在真核生物中DNA复制开始于特定位点.以酵母为例:第四章DNA的复制(4)

DNA聚合酶α（Ⅰ）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）βγ位置核核核核线粒体功能后随链的合成和引发前导链的合成修复修复复制分子量300kD170～230kD250kD40kD180～300kD亚基催化核心（180kD）两个引物酶（60,50kD）一个未知催化核心（125kD）一个未知（25kD）需PCNA（37kD）催化核心一个未知催化催化3′→5′外切－++－+双脱氧T不影响不影响弱抑制抑制蚜黄素抑制抑制抑制不影响不影响

一、真核生物的DNA聚合酶第四章DNA的复制(4)表

真核生物DNA复制需要的酶和蛋白蛋白亚基功能DNA聚合酶α/引发酶4后随链合成（DnaG）DNA聚合酶δ2前导链合成PCNA1行进性因子（β夹子)复制因子C3定位因子(γ复合体)复制因子A3单链结合(SSB)拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ

维持DNA的拓扑结构第四章DNA的复制(4)图11-36真核的DNA复制模型

第四章DNA的复制(4)复制体性质/成分细菌真核生物一般性质的比较

复制起点单个很多延伸速度100kbpmin-12kbpmin-1冈崎片段1-2kbp100-200bp引发策略引发酶产生引物，由polIII延伸由polα延伸，由polδ完成复制多聚酶单体有不同进行性的异源二聚体每条链有不同的酶，有不同的进行性拓扑学疏松和卷曲之间存在平衡，净为负超螺旋浓缩在核小体中的负超螺旋。高级结构影响拓扑学复制体成分的比较

复制多聚酶polIII全酶polδ/polα进行性因子β亚基PCNA定位因子夹γ亚基RF-C引发酶DnaGpolα:引发酶解旋酶DnaB(定位需要DnaC)？几个候选者引物去除RNaseH和polIRNaseH1和MF-1核酸酶后滞链修复polI和DNA连接酶polδ/polε和DNA连接酶I拓扑异构酶DNA回旋酶topoII单链结合SSBRF-A原核﹑真核生物DNA复制比较第四章DNA的复制(4)二、端粒的复制◎端粒酶

(telomerase)组成端粒酶RNA(humantelome