【细菌耐药基因的分子检测方法探究综述报告7000字】

细菌耐药基因的分子检测方法研究综述报告摘要临床治疗过程中，细菌性感染治疗时所采用的主要药物就是抗生素，但大规模使用抗生素显然会导致细菌产生耐药性。现阶段，在临床治疗方面，已经出现了由于抗生素等药物的使用而导致的细菌耐药性。检测细菌耐药性，不仅可以进一步研究病原菌流行病学、精准及时治疗细菌感染，还可以有效地避减少传播、发生细菌耐药的情况。因此，如何检测细菌耐药基因是一个非常值得思考的问题，引起了众多学者的关注，其直接影响到临床重症感染紧急用药。本文从细菌耐药、细菌耐药基因的检测方法两方面综述当前国内外学者关于细菌耐药基因分子检测的相关研究，梳理当前检测细菌耐药基因的方法，以期为有关科研人员更好地开展检测工作提供参考，有效预防细菌耐药的发生与传播。关键词：细菌耐药；分子检测；基因；感染目录TOC\o"1-3"\h\u17086一、绪论 319252（一）研究背景 37668（二）研究目的与意义 38251（三）国内外研究现状 411521二、细菌耐药的相关概述 4591（一）感染与抗菌药物 411318（二）细菌耐药机制 56909三、细菌对抗菌药物产生耐药性的原因 52918（一）抗菌药物使用不合理 515709（二）抗菌药物选择不合理 512693（三）抗菌药物应用不适用于症状范围 615237（四）抗菌药物的选择缺乏依据 66934（五）联合用药不合理 612466四、抗菌药物耐药检测方法 73490（一）生化检测方法 711640（二）分子生物学方法 814899五、遏制抗菌药物产生耐药性的方法 824253（一）建立医药监管体系 88868（二）加强用药管理 819789（三）组织群众学习相关医学知识，使用替代药物 92408（四）严格要求医生按患者的具体状况给药 9837结论 99170参考文献 10绪论研究背景全球都存在滥用抗菌药物的现象，即使在经济条件和医疗技术发达的国家，这一问题仍然困扰着各国。近年来，我国抗菌药物滥用问题日益突出。对新型的抗菌药物进行研究和开发的速度赶不上耐药菌发生变化的速度，而且进入市场的速度比较忙，数量也很少。细菌的耐药性因为受到不同因素的影响而变得不同，所以，为了对耐药菌的变迁进行了解，对耐药菌的传播进行遏制的最好的方法就是对细菌的耐药性进行监测。本文全面分析了细菌产生耐药性的机理及原因，为临床抗菌药物规范使用提供建议。以解决我国抗菌药物耐药性问题提供理论支持，并采取相应措施。研究目的与意义当前社会，人们过度使用了抗感染的药物，耐药菌也经常的从药物中被检测出来，对抗菌药物中的耐药模进行了改变，尤其是多重耐药细菌被检查出来的概率也在不断增加，临床上，抗感染的治疗也面临着巨大的挑战。在临床使用中，因为感染的程度不同，监测治疗中看到的细菌所具有的耐药性，对临床中怎样使用药物具有指导作用，所以，在对临床进行实践的过程中，对细菌进行监测非常重要，能够帮助免疫力低下或者病情比较严重的危急病人对抗菌药物进行合理的使用，同时还能够对耐药菌的产生和传播进行遏制。国内外研究现状临床使用抗生素时，多数医生凭经验用药，患者病原学检查率不高，或在利益驱使下选择昂贵的抗生素、新药和进口药物，抗生素选择不正确，疗程和配伍不合理，联合用药不当等。从2018年全国对耐药性进行的检测可以看出，平均检测出MRSA占了62%[1][2]。AiX等对广州市三个中心的2059例儿童粪便标本进行了深入研究与分析。从欧盟的调查结果中可以看出，每年因为多重耐药菌感染而死亡的人数就有2.5万人，给医疗保健和社会所拥有的生产力带来了巨大的损失，这些损失已经达到了9亿欧元。而美国每年感染细菌的人数也有200多万,然而这部分的细菌已经对常用的抗菌药有了一定的耐药性。为了解决这一问题，美国每年需要从医疗和保健机构拿出200亿美元。2017年韩国对全球的耐药性进行了监测，从结果中可以看出，有一半的金黄色葡萄球菌对头孢产生了耐药性。细菌耐药的相关概述（一）感染与抗菌药物感染性疾病是一种常见病，也是一种多发病，严重影响了人类的身体健康。学者Myung-Jin表示在临床治疗方面，多种器官疾病晚期的致死原因和并发症均为感染性疾病，在治疗感染性疾病时，必不可少的就是抗菌药物，它的使用，大大降低了感染患者的死亡率。学者F.Fenollar在对开发抗菌药物的历史回顾之后，表示目前在临床上已有上百种抗菌类药物投入使用，上千种抗生素药物被开发。学者PaigeN等人表示抗真菌药物、抗细菌药物共同组成了抗菌药物，这些人工合成药物均具有抗菌活性。而学者KrisnaN对抗菌药物进行了分类，表示按照化学结构抗生素可以分为多种类型，譬如，四环素类；再如，氨基糖苷类等（二）细菌耐药机制细菌经过了长时间的进化，形成了比较复杂的耐药机制和体系。作为学者，MinQiao指出，细菌可以把自身所具有的染色体的DNA进行改变，把耐药的基因经过增殖，然后分裂，达到传递的目的，也就是说DNA在细菌内部进行了垂直传播。其实现了垂直传播。学者Wittwer则表示细菌之间也能够实现水平传播，遗传原件可以通过外源获得。学者SatyvaldyJatayev表示细菌的耐药机制之一主要是为了对菌胞膜的渗透性进行改变，抗菌药物需要依次通过细胞膜，然后是细胞壁，最后进入到细菌细胞，并发挥出它控制细菌或者杀死细菌的作用，所以细菌在对药物进行抵抗时就形成了多种的防御机制。而学者Huey-Ling则认为细菌主动外排为细菌耐药机制之一，抗菌药物与细菌外膜孔蛋白变异常协同作用，实现主动外排，细菌耐药的水平也就随之提高。学者KevinE表示在生物细胞中，广泛存在着主动泵出系统，在这些外排泵底物特异性差，往往表现为多重耐药。三、细菌对抗菌药物产生耐药性的原因（一）抗菌药物使用不合理俗话说，抗菌药物是一种化学物质，能够对细胞的发育产生影响。并且种类很多，每种药物都有各自的特点，因此在使用时应针对不同的疾病、人群、细菌等，作出正确的选择。但是在很多情况下，抗菌药物的适用是有限的，并不是所有人都适合使用抗菌药物，比如一些儿童患者、孕妇和上了年纪的老人对很多抗生素是排斥的，但是很多人注意不到这一点，把抗菌药物习惯性的当成救命稻草，到最后却适得其反，产生不良反应。（二）抗菌药物选择不合理许多人过于依赖抗菌药物，总觉得这一类药物可以治愈各种疾病，一有个头疼脑热就习惯性地使用，他们通常不会去专门的药店询问该用什么药，也不会去医院就诊，他们根据自己的经验和用药习惯选择服用抗菌药物，导致经验性药物过量。相关的细菌说明书中已经指出，在细菌感染的情况下，可以使用一些适当对应的药品进行治疗，比如可采用人体输入青霉素或者口服其他抗菌药物等。这里我们需要考虑一种情况就是有些人对抗菌药物过敏的情况，这时最佳的选择就是使用头孢菌素。按照医药方面的一些规定说明，在治疗细菌感染时，要根据病情的严重程度选择合适的抗菌药物，不能越级使用，以免产生副作用。（三）抗菌药物应用不适用于症状范围抗菌类药物可以在非常低的浓度下破坏细菌和病毒等微生物。它的作用是杀死感染的微生物。其目的是杀死病原体，控制疾病，并最终治愈它们。但是很多人在头痛或发烧的时候却选择服用抗菌药物，并且大多数的地方医疗机构，县级医院、诊所等都不加阻拦。据世界卫生组织多次公开发言可知，抗菌药物在原则上其实是不能治愈感冒或是流感等病毒感染。但是很多地方当出现有流感等传染病，或是类似的身体炎症时，还是有很多人选择使用抗菌药物进行消炎，其不适用于这一症状，不仅没有治疗好患者，反而还对抗菌药物产生了耐药性。（四）抗菌药物的选择缺乏依据在抗菌药物的选择过程中，我们还需要考虑到药物的感染病体，患者是否有过敏史，以及患病的综合情况等等。比如某些医院的医疗水平比较有限，对于感染菌的培养，以及药敏实验，通常都需要几天的周期性观察才能够确定。受一定的限制，一般人大多数人在发病前不会来医院，而凡是来医院治疗的人，则情况就比较急。又不可能花费较高的代价，来进行药物敏感监测，这也造成医生主要采取经验治疗，从而导致科学严谨性较低。根据2000多例病历显示，在这其中做过菌前培养或药物过敏测试的不到3%，在实际治疗过程中，最常用的方法就是一种抗菌药使用几天之后，如果得不到起码的疗效，则直接更换抗菌产品。也正是处于这个原因考量，某医院通常会选用过敏指数较低的广谱抗菌药，而对于高敏指数的窄谱抗菌药物的使用频率则是少之又少。（五）联合用药不合理在特殊的情况下，在一定程度上联合使用抗菌药物是可以的。但是很多的医生对医药的了解并不是很全面，通常会有很多配药方面的禁忌。比如笨挫西林这种青霉素的酸性是比较稳定的，但是其他的青霉素的酸性极度的不稳定。葡萄糖的酸碱综合测试值是在四到六之间，是属于酸性的，把它和氨节西林混合使用，就会导致药物遭到稀释。因此，这种药品就应该选取比较中性的注射液来融合使用。现在，很多新型的药物不断应用到医学中，同时也就有很多的药物方面的配伍禁忌。所以，在联合用药的过程中一定要考虑全面，不能因为用药不当而使患者痛苦。四、抗菌药物耐药检测方法传统检测抗菌药物所具有的耐药性的方法有纸片扩散法等，这些方法都是借助耐药表型对耐药菌进行分析的方法为基础。这种类型的检测方法在使用的过程中非常方便，成本也比较低，可供选择的方式也很多，但是需要长时间的对菌株进行培养。还有一种方法就是对耐药酶具有的活性进行检测，以此为基础，对耐药酶以及底物产生的水解反应进行检测，同时检测指示剂中颜色发生的变化。该检测方法更加方便、快速，现如今己在临床诊断中广为应用。（一）生化检测方法在检测细菌耐药基因时，一个非常主要的方法就是生化检测方法，主要有两种方式，一种为比色法，另一种为关于电离飞行时间有关的质谱技术。学者UrsulaTheuretzbacher表示利用分光光度计测量或肉眼观察，水解活性在试剂介质中的变化，就是比色法[14]。学者AnitaL认为对于窄谱的内酰胺酶，显色底物具有一定抗性，但是ESBLS能够将其水解，原本黄色的液体就会变成红色，因此ESBLS菌株就可以根据颜色变化被判断出来。而学者王素梅、张健则表示在检测尿液或血液中的ESBLS时，比色法被广泛应用，主要是因为其能够快速得出结果，且操作简单，但是在具体应用的过程中非靶向酶火灾一定程度上影响显色反应，因此可以应用的标本类型比较有限。（二）分子生物学方法近年来，分子生物学技术在临床实验室占据了越来越重要的地位。对微生物进行检测也可以使用各种不同的PCR技术，譬如数字PCR，还比如多重OCR等。学者王旭恩表示聚合酶链式反应作为常规的检测方法，已被批准用于MRSA、结核耐药检测[18]。而学者苏屿、李天娇则明确表示目前对耐药基因的分子检测方法有：包括实时PCR技术在内的普通PCR技术、PCR杂交技术（如基因芯片，特异性识别分子序列）、测序（特别是二代测序，NGS）等。PCR方法是临床实验室最早用来检测肠杆菌科中内酰胺酶相关耐药基因的分子方法。学者马玉兰、宋文杰等人认为该方法首先利用特异性引物扩增目的基因，然后产物通过电泳检测是否有目的条带。而学者TingShi则认为应用PCR技术采用全封闭反应，无须PCR后处理，从而避免了扩增子对环境污染。利用不同的荧光染料可实现一管对多个对象的检测，操作简单快速、特异性强、灵敏度高。第三代DNA所使用的测序技术不用对PCR进行扩增，只需在十分钟内对基因进行组测序，与此同时，还能对菌株进行鉴定，并进行分析；对耐药基因谱和毒力基因谱进行筛查；以及对基因的突变进行分析。五、遏制抗菌药物产生耐药性的方法（一）建立医药监管体系抗菌药物滥用是一个综合问题，需要政府的政策和急需政府和卫生保健方面一起协作，同时借助全社会的力量来共同解决。美国和瑞典作为监管药物滥用的体系，在全国的范围内对抗菌药物的耐药性进行了宣传教育，通过及时的检测，做出相应的报告。在我国，也对使用抗菌药物的情况进行了实时的监测，并提前做出了预测，同时建议在我国家建立对临床抗药菌的进行监测的网络，根据不同地区对细菌耐药性监测得出的结果，来监测我国的滥用药物的实际情况，并对这种情况进行管理。从抗药菌药物的监管的角度来看，国外已经制定出了合理有效的方案，在以后的发展中，我国可以从国外的医药管理所积累的经验中吸取经验教训，来对我国滥用抗生素的监管体系进行完善。（二）加强用药管理本质上抗菌药物并不能发挥出有效的消炎效果，但是对于一些由炎症所引起的微生物，却有着非常好的治疗效果。因此，抗菌药物不适合由病毒引起的炎症，只适合因细菌而引起来的炎症。它们不能防止感染，如果用抗菌药物来预防流感等疾病，那是有害无益的。如果没有明显的病原微生物时，可使用广谱抗菌药物。如果鉴定出病原微生物，可以用来治疗或抑制致病微生物感染，最好使用相应的窄谱抗菌药物，这对微生物具有致命的作用。（三）组织群众学习相关医学知识，使用替代药物有人自认为“久病成良医”，胡乱服用抗生素。在有些家庭中常备阿莫西林，不论牙痛、腹痛、腹泻，均用阿莫西林解决，不注重其用法、查出需要进行个体化调整的药物，与疗程以及适应症。此外，许多患者缺乏药品知识，误认为新型抗菌药物就比旧的好，价格越贵越好，觉得可以直接消炎，或认为一起使用的种类越多效果越好等。这些想法和认识都是不对的，患者应该积极主动的去学习这方面的知识，而不是道听途说，盲目地服用这些抗菌类药物。什么症状对应什么药，这些都是需要专业的医生通过对患者进行针对性的诊断才能给出具体建议的。患者不能凭着经验盲目的乱吃药。与此同时，患者自身也还需明白，抗菌药物不是万能的，虽然可以治疗一些疾病，但是仍然存在一些问题，所以很多时候患者可以选择使用替代性药物。（四）严格要求医生按患者的具体状况给药在老年人、孕妇、儿童、肝功能、肾功能不全或者免疫力低等情况下，必须充分考虑抗菌药物的使用。对于抗生素的剂量和治疗应该根据年龄和适应症进行调整。肝酶系统，肾排泄不完整的，有一些副作用较大的药物例如磺胺类、四环素类、多粘菌素、氯霉素等在使用的时候应该先检测血药浓度。其中β-内酰胺类抗生素是最安全的品种，对于哺乳期的患者以下抗菌药物的种类对其有不利的影响，如氯霉素物、甲硝唑、等浓度特别低，通过哺乳的方式口服吸收，不需要停止母乳喂养。儿童患者在使用氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物时要慎用。医生应严格根据不同患者、不同情况严格给药。结论医院的抗菌药物种类很多，而且这些药物的选择也非常多，充分满足了各类患者的需求。同时我们也可以发现很多的医生对抗菌药物的选择都有盲目性，使用时都存在用药过度，费用高昂的特点。在我国很多地方都有医生不按照规定使用抗菌药品的现象，这样就加剧了病人的痛苦，同时还要付出高昂的费用，导致了资源的严重浪费，更重要的是对细菌还出现了耐药性，使得抗菌药品达不到预期的效果。这就是为什么我们需要提高医生的整体素质，使他们能够明智地使用抗菌药物。同时，还要要求医护人员在使用抗菌药品的过程中，一方面要考虑到治疗效果，更多的还要考虑药品对患者的不利影响和患者的经济方面的承受能力，这样才能让医院使用的抗菌药物更加的安全，效果更好，成本更低。结合上面所讲的内容得知，PCR技术是一种检测基因的耐药性的检测技术，主要应用于临床，目前技术比较成熟。但是对细菌的耐药性进行检测时，仍然有很多无法解决的问题存在，上面所讲的技术，在对细菌的耐药性进行基因检测之前，要对核酸进行提取，并对PCR进行扩增，这种操作比较复杂，最后得到的结果也会依赖于DNA进行的测序结果。由于人们逐渐了解了病原菌所具有的耐药基因以及临床制药的机制两者之间的关系，测序技术也得到了深入发展，同时降低了检测的成本。一种新型的测序技术很快会在临床中使用，让治疗临床病原菌的感染有了革命性的变化。参考文献[1]李昕,曾洁,王岱,薛云新,赵西林.细菌耐药耐受性机制的最新研究进展[J].中国抗生素杂志.2020(02)[2]向蕾,陈仕菊,王昕,吕星,陆家海,房师松.实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究[J].热带医学杂志.2014(04)[3]MassinissaSiMehand,FarahAl-Shorbaji,PiersMillett,BernadetteMurgue.TheWHOR&DBlueprint:2018reviewofemerginginfectiousdiseasesrequiringurgentresearchanddevelopmentefforts[J].AntiviralResearch.2018[4]Myung-JinMun,Joon-YongBae,JinHyuckKim,SooBokKim,IlseobLee,JinIlKim,MeeSookPark,Man-SeongPark,YongSukNam.One-stepmultiplexreal-timeRT-PCRfordetectionandtypingofdenguevirus[J].MolecularandCellularProbes.2018[5]F.Fenollar,O.Mediannikov.EmerginginfectiousdiseasesinAfricainthe21stcentury[J].NewMicrobesandNewInfections.2018[6]MauricioT.CaballeroMD,FernandoP.PolackMD.Respiratorysyncytialvirusisan“opportunistic”killer[J].PediatricPulmonology.2018(5)[7]PaigeN.Dahlgren,KanokwanBishop,ShatovishaDey,Brittney-SheaHerbert,HiromiTanaka.DevelopmentofaNewMonochromeMultiplexqPCRMethodforRelativeTelomereLengthMeasurementinCancer[J].Neoplasia.2018(5)[8]KrisnaN.A.Pangesti,MoatazAbdElGhany,MichaelG.Walsh,AlisonM.Kesson,GrantA.Hill‐Cawthorne.Molecularepidemiologyofrespiratorysyncytialvirus[J].ReviewsinMedicalVirology.2018(2)[9]MinQiao,Guang-GuoYing,AndrewC.Singer,Yong-GuanZhu.ReviewofantibioticresistanceinChinaanditsenvironment[J].EnvironmentInternational.2018[10]M.Li,R.A.Palais,L.Zhou,C.T.Wittwer.QuantifyingvariantdifferencesinDNAmeltingcurves:Effectsoflength,meltingrate,andcurveoverlay[J].AnalyticalBiochemistry.2017[11]SatyvaldyJatayev,AkhylbekKurishbayev,LyudmilaZotova,GulmiraKhasanova,DaurenSerikbay,AskarZhubatkanov,MakpalBotayeva,AibekZhumalin,ArysgulTurbekova,KathleenSoole,PeterLangridge,YuriShavrukov.AdvantagesofAmplifluor-likeSNPmarkersoverKASPinplantgenotyping[J].BMCPlantBiology.2017(2)[12]Huey-LingYou,Shun-JenChang,Hong-RenYu,Chia-ChinLi,Chang-HanChen,Wei-TingLiao.BMCPediatrics.Simultaneousdetectionofrespiratorysyncytialvirusandhumanmetapneumovirusbyone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRinpatientswithrespiratorysymptoms[J].2017(1)[13]KevinE.Eboigbodin,KirsiMoilanen,SonjaElf,MarkHoser.Rapidandsensitivereal-timeassayforthedetectionofrespiratorysyncytialvirususingRT-SIBA?[J].BMCInfectiousDiseases.2017(1)[14]UrsulaTheuretzbacher.GlobalantimicrobialresistanceinGram-negativepathogensandclinicalneed[J].CurrentOpinioninMicrobiology.2017[15]AnitaL.Rack-Hoch,GudrunLaniado,JohannesHübner.ComparisonofinfluenzaandRSVdiagnosticfromnasopharyngealswabsbyrapidfluorescentimmunoassay（Sofiasystem）andrapidbedsidetesting（BinaxNOW）vs.conventionalfluorescentimmunoassayinaGermanuniversitychildren’shospital[J].Infection.2017(4)[16]王素梅,张健东,王宇凡,刘树业.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分型[J].中华医院感染学杂志.2019(17)[