短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术的制作方法

短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术的制作方法专利名称：短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术的制作方法技术领域：本发明属于基因工程，具体地说涉及一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，该技术可应用于法医学、考古学、遗传学和肿瘤学等领域的个体识别、亲权鉴定以及遗传和肿瘤病的诊断等方面。人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，被称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7bp组成的叫微卫星，所以又称为短串联重复序列(Shorttandemrepeat，SIR)。不同人体基因组的卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近几年在法医学、考古学、遗传学和肿瘤学等领域建立了一种崭新的对人体进行个体识别、亲权鉴定以及对遗传和肿瘤病进行诊断的STR-PCR(短串联重复序列聚合酶链反应)技术，从而给这些领域的发展带来了新的革命性变化。在这一技术中，为了准确地给各等位基因进行定位和识别，必须设置与各等位基因相对应的等位基因阶梯(AlleleLadder)为标准参照物(Markers)。因等位基因阶梯中的每一基因片段的长度均是已知的，将它与各待测样品的扩增产物在相同电泳条件下的相邻泳道上进行电泳分离，染色后进行对比，就很容易判断待测样品的基因型，所以，等位基因阶梯在STR-PCR的结果判断中至关重要。目前国内制备各STR位点等位基因阶梯的方法有两种一种是从人基因组的每个位点上筛选能代表各等位基因片段的几种扩增产物，混合后直接用于AlleleLadder；另一种方法是将能代表某位点上所有等位基因的扩增产物混合物，稀释后再次扩增，将再次扩增的产物用作等位基因阶梯。按上述方法制备的等位基因阶梯有很多不足之处(1)、直接选择人基因组作为扩增模板时，往往出现有些带是重复扩增，而有些带确很难找到相应的的扩增模板，由此制备的等位基因阶梯的各条带的颜色深浅不一，甚至出现缺带现象。(2)、要批量生产，必须要经常去挑选和制备能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的纯度及含量等均有出入，使其扩增条件难以标准化。(3)、人基因组DNA的分子量太大，结构极其复杂，难以线性化和解链，所以扩增产物的产量较低，而且非特异扩增较严重，对产物的纯化较困难，不适合批量生产。(4)、若用人基因DNA的扩增产物混合后再次进行扩增，其非特异扩增更加严重，扩增产物中各条带的颜色更不均一，此法更不适合批量生产。(5)、将扩增产物的混合物直接用于等位基因阶梯时，在短时间内可能出现降解，使其各条带模糊不清，或者构型有所改变，使其电泳迁移率发生变化。由于这些原因引起的质量变化均不能作为标准参照物使用。由于上述原因，至今尚无任何单位可以批量生产一种稳定的STR等位基因阶梯供给有关部门使用。本发明的目的就是为了提供一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，该技术能批量生产稳定性好的(即在常温以下至少在一年之内不出现降解和构型改变，在各种浓度的变性或非变性胶中均保持与扩增产物的电泳迁移率一致)，既可用于银染法，也可用于荧光法的等位基因阶梯试剂。一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，其特征在于包括以下生产顺序步骤1、从人的有核细胞中提取DN/A取抗凝血20μl，加红细胞裂解液D.5ml左右，充分混匀后，5000rpm离心5分钟，再用红细胞裂解液洗两遍，沉淀加20μl白细胞裂解液，混匀后，100℃煮10分钟，取1μl进行STR-PCR扩增；2、按国内外公开发表的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻找各位点的等位基因型；3、按德国QIAGEN公司生产的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同类产品)说明书，快速纯化PCR产物；4、按Promega公司生产的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同类产品)说明书将纯化的PCR产物连接到T载体上；5、按《分子克隆》第二版中文版第19页的方法提取质粒DNA，并进行纯度和定量测试；6、用STR-PCR技术分别制备各等位基因片段，然后对扩增产物进行纯化和定量测定；7、将各位点的等位基因片段进行序列分析，以测定各片段的bp数及串联重复单位数；8、将各片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量分装；9、出厂前再次进行电泳检测。本发明有如下的特点1、用于扩增各等位基因的模板是通过分子克隆技术制备的，该模板的DNA序列与人基因组DNA上同一位点的序列完全相同，因此用这两种不同模板得到的扩增产物的DNA序列及构型完全一致，从而确保了这两种扩增产物的电泳迁移率保持不变。2、通过分子克隆技术得到的模板的长度远小于人基因组DNA的长度，容易线性化和解链，在相同条件下，得到的扩增产物远高于用人基因组DNA扩增的量，而且非特异性扩增产物也远少于人基因组DNA的扩增产物，所以容易批量生产。3、各等位基因片段是一条一条的制备，然后分别测定其含量，再等量混合后制成等位基因阶梯，这样就确保了每条带颜色的深浅是均一的。4、用分子克隆技术制备的模板更容易作到定性定量测定，一次标化好的模板可用好几年，这不但大大地减化了反复从人的有核细胞中去寻找和提取各等位基因模板的烦琐工作，更主要的是尽可能地避免了因为每批模板质量的差异，给生产的标准化和产品质量的稳定性带来的负面影响。5、在批量生产等位基因阶梯时，所用引物之一的5’端标上荧光素后，便可得到可供荧光检测的等位基因阶梯。6、按本专利制备等位基因阶梯不但可批量化、标准化生产，而且产品的稳定性特别好，在常温以下至少在一年之内产品不存在降解和构型改变等，其质量完全可以达到同类进口试剂的水平。下面详细说明。本发明包括以下生产顺序步骤1、从人的有核细胞中提取DNA取抗凝血20μl，加红细胞裂解液0.5ml左右，充分混匀后，5000rpm离心5分钟，再用红细胞裂解液洗两遍，沉淀加20μl白细胞裂解液，混匀后，100℃煮10分钟，取1μl进行STR-PCR扩增。2、按国内外公开发表的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻找各位点的等位基因型。以VWA位点为例说明如下引物序列分别为5’-GGGATTTCCCTATGGATTGG-3’和5’-GCGAAAGAATGAGGACTACAT-3’。如果用荧光法进行检测，需在其中一条引物的5’端标上荧光素。每一扩增样品包含2-40ng人类基因组DNA，1×Taq缓冲液，1.5mmol/LMgcl，每种核苷酸150μmol/L，1UTaq聚合酶，每种引物0.25μmol/L，反应体积25μl。在热循环仪中先95℃预变性2分钟，然后循环30次，每次94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。用7.5％聚丙烯酰胺进行电泳，然后银染。通过比较样品PCR扩增产物与人类VWA位点AlleleLadde的电泳谱带位置确定VWA基因型。3、按德国QIAGEN公司生产的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同类产品)说明书，快速纯化PCR产物。具体方法如下加5倍体积的PE至1体积的PCR产物中，混合后加到QIAquick柱中，将该柱置于2ml收集管之上，快速离心30-60秒，弃去离心液，用0.75mlBufferPE加到柱中再快速离心30-60秒，弃去离心液，将柱置于新的1.5ml离心管之上，加适量的水到柱中，快速离心1分钟，收集离心液备用。4、按Promega公司生产的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同类产品)说明书将纯化的PCR产物连接到T载体上，即2×T4DNAligasebeffer5μl，pGEM-T1μl，T4DNAliggase1μl，经纯化的PCR产物适量，然后加水至10μl4℃连接过夜，再转化到大肠杆菌中，然后从选择培养基平板上挑取单菌落，从中挑选所需要的重组菌。5、按《分子克隆》第二版中文版第19页的方法提取质粒DNA，即将LB液体培养基培养的重组菌转移到1.5ml离心管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，加100μl预冷的溶液I，剧烈振荡使其充分悬浮；然后再加200μl新配制的溶液II；盖紧管口，快速颠倒离心管5次后置于冰上；再加150μl冰冷的溶液III，温和振荡10秒钟后，再置于冰上3-5分钟，4℃12000rpm离心10分钟；将上清转移到另一离心管中，加等体积的酚/氯仿，振荡均匀后，4℃12000rpm离心2分钟；将上清转移到另一离心管中，加2倍体积的乙醇，充分混匀后，室温下放2分钟，4℃12000rpm离心5分钟；再用1ml70％乙醇洗一次质粒DNA，然后去掉上清，在空气中使其干燥；加适量的无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解质粒DNA。然后用分光光度法测定其纯度及含量，并保存在-20℃备用。6、用STR-PCR技术分别制备各等位基因片段，在制备带荧光基团的等位基因阶梯时，需在其中一条引物的5’端先标上荧光素。然后对扩增产物进行纯化和定量测定。7、将各位点的等位基因片段进行序列分析，以测定各片段的bp数及串联重复单位数。8、将各片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量分装。9、出厂前再次进行电泳检测。权利要求一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，其特征在于包括以下生产顺序步骤1、从人的有核细胞中提取DNA取抗凝血20μl，加红细胞裂解液0.5ml左右，充分混匀后，5000rpm离心5分钟，再用红细胞裂解液洗两遍，沉淀加20μl白细胞裂解液，混匀后，100℃煮10分钟，取1μl进行STR-PCR扩增；2.按国内外公开发表的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻找各位点的等位基因型；3.按德国QIAGEN公司生产的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同类产品)说明书，快速纯化PCR产物；4.按Promega公司生产的pGEM-TVectorSyslems(或其它公司的同类产品)说明书将纯化的PCR产物连接到T载体上；5.按《分子克隆》第二版中文版第19页的方法提取质粒DNA，并进行纯度和定量测试；6.用STR-PCR技术分别制备各等位基因片段，然后对扩增产物进行纯化和定量测定；7.将各位点的等位基因片段进行序列分析，以测定各片段的bp数及串联重复单位数；8.将各片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量分装；9.出厂