基因工程的基本原理和技术专家讲座

教学目标

知识与能力1.简述DNA重组技术所需三种基本工具作用。2.认同基因工程诞生和发展离不开理论研究和技术创新。二、教学重点和难点1.教学重点：DNA重组技术所需三种基本工具作用。2.教学难点:基因工程载体需要具备条件。基因工程的基本原理和技术专家讲座第1页基因工程基因工程的基本原理和技术专家讲座第2页每100kg猪或牛胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据调查：年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素基因工程的基本原理和技术专家讲座第3页抗虫害玉米转鱼抗寒基因番茄转基因

鲑鱼基因工程产品基因工程的基本原理和技术专家讲座第4页基因工程产物基因工程的基本原理和技术专家讲座第5页转黄瓜抗青枯病基因甜椒乳汁中含有些人生长激素转基因牛(阿根廷)基因工程的基本原理和技术专家讲座第6页什么叫基因工程？基因工程又叫DNA重组技术。该技术是在生物体外，经过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表示，产生出人类所需要基因产物。（一）基因工程概念基因工程的基本原理和技术专家讲座第7页基因工程概念基因工程别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果（目标）DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表示按照预先设计蓝图，定向改变生物遗传特征，创造出新型生物基因工程的基本原理和技术专家讲座第8页基因工程研究理论基础科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论基因工程的基本原理和技术专家讲座第9页科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因分离定律和自由组合定律基因工程的基本原理和技术专家讲座第10页科技探索之路早期基础理论

摩尔根证实基因在染色体上，并提出基因连锁交换定律。基因工程的基本原理和技术专家讲座第11页科技探索之路后期基础理论

艾弗里证实DNA是遗传物质，DNA可从一个生物个体转移到另一个生物个体。基因工程的基本原理和技术专家讲座第12页科技探索之路后期基础理论

沃森、克里克提出DNA双螺旋结构模型。基因工程的基本原理和技术专家讲座第13页基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证实DNA半保留复制基因工程的基本原理和技术专家讲座第14页科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制基因工程的基本原理和技术专家讲座第15页科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸遗传密码，1966年霍拉纳用试验加以证实。基因工程的基本原理和技术专家讲座第16页基础理论和技术发展催生了基因工程

DNA是遗传物质证实DNA双螺旋结构和中心法则确实立遗传密码破译（遗传密码通用性）基因运载体发觉工具酶创造DNA合成和测序技术创造DNA体外重组实现重组DNA表示试验成功第一例转基因动物问世PCR技术创造基础理论技术创造基因工程的基本原理和技术专家讲座第17页问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一个能够合成毒蛋白基因。让细菌毒蛋白基因在棉花细胞中表示，培育出抵抗棉铃虫害抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程的基本原理和技术专家讲座第18页基因工程培育抗虫棉关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞基因工程的基本原理和技术专家讲座第19页处理培育抗虫棉关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝纫针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞载体基因工程的基本原理和技术专家讲座第20页DNA重组技术基本工具

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

DNA连接酶——“分子缝纫针”

基因进入受体细胞载体——“分子运输车”

基因工程的基本原理和技术专家讲座第21页一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1、主要起源：2、特点：3、作用：

识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列（不一样限制酶能识别不一样特点核苷酸序列），而且以不一样方式在两个特殊碱基之间切断DNA双链。主要从微生物中分离纯化使每条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键断开基因工程的基本原理和技术专家讲座第22页磷酸二酯键T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+基因工程的基本原理和技术专家讲座第23页O基因工程的基本原理和技术专家讲座第24页4、限制酶识别序列Goon大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成少数识别序列由4、5或8个核苷酸组成基因工程的基本原理和技术专家讲座第25页限制酶识别序列：Goback基因工程的基本原理和技术专家讲座第26页

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback基因工程的基本原理和技术专家讲座第27页

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示Goback基因工程的基本原理和技术专家讲座第28页什么叫黏性末端？被限制酶切开DNA两条单链切口，带有几个伸出核苷酸，它们之间恰好互补配对，这么切口叫黏性末端。基因工程的基本原理和技术专家讲座第29页SmaⅠ平末端平末端基因工程的基本原理和技术专家讲座第30页限制酶DNA解旋酶区分限制性内切酶与DNA解旋酶区分切割特定核苷酸序列磷酸二酯键将DNA两条链氢键打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区分限制性内切酶与DNA水解酶区分切割特定核苷酸序列磷酸二酯键，形成片段DNA.切割磷酸二酯键，形成单个脱氧核苷酸。Goback基因工程的基本原理和技术专家讲座第31页要想取得某个特定性状基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。假如把两种起源不一样DNA用同一个限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同黏性(平)末端，然后让二者黏性(平)末端黏合起来，就似乎能够合成重组DNA分子了。思索?基因工程的基本原理和技术专家讲座第32页……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不一样起源DNA片段混合将不一样种起源DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一个基因工程的基本原理和技术专家讲座第33页可把黏性末端之间缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键基因工程的基本原理和技术专家讲座第34页二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:恢复被限制酶切开两个核苷酸之间磷酸二酯键②作用原理：催化磷酸二酯键形成基因工程的基本原理和技术专家讲座第35页DNA连接酶——“分子缝纫针”连接酶有两种：一个是从大肠杆菌中分离得到，称之为E·coli连接酶。另一个是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA缺口，而不能连接单链DNA。E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。基因工程的基本原理和技术专家讲座第36页

T4DNA连接酶还可把平末端之间缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶基因工程的基本原理和技术专家讲座第37页③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶起源功效大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差异基因工程的基本原理和技术专家讲座第38页DNA聚合酶DNA连接酶区分1区分2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为何?1)只能将单个核苷酸连接到已经有核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸经过磷酸二酯键连接成一条互补DNA链2)将DNA双链上两个缺口同时连接起来，不需要模板基因工程的基本原理和技术专家讲座第39页外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？导入过程需要运输工具——运载体。基因工程的基本原理和技术专家讲座第40页三、基因进入受体细胞运载体——”分子运输车”运载体作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。基因工程的基本原理和技术专家讲座第41页三、基因进入受体细胞载体——“分子运输车”假如载体对受体细胞有害将怎样？假如目标基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目标基因是否进入受体细胞，你怎样觉察？基因工程的基本原理和技术专家讲座第42页作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保留。2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，方便目标基因插入到载体上去。3）含有一些标识基因，便于进行筛选。如抗菌素抗性基因、产物含有颜色反应基因等。载体DNA必须是安全,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外其它生物细胞中去;5)载体DNA分子大小应适合,方便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.基因工程的基本原理和技术专家讲座第43页惯用运载体主要有两类：1）细菌细胞质质粒2）噬菌体或一些动植物病毒基因工程的基本原理和技术专家讲座第44页惯用载体：质粒能复制并带着插入目标基因一起复制有切割位点有标识基因存在，可用含氨苄青霉素培养基判别基因工程的基本原理和技术专家讲座第45页1.在基因工程中，切割运载体和含有目标基因DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶A课堂练习基因工程的基本原理和技术专家讲座第46页2.不属于质粒被选为基因运载体理由是A、能复制