中国极地微生物的研究进展专家讲座

中国极地微生物学考查研究简史

从1981年起,中国微生物学家即涉足南极,并于1987年发表了第一篇论文(Nichuzhietal.,1987),即《ThehetertrophicmicrobesindryVictorialandandRossIslandAntarctica》；1984年之前,中国学者曾参加南大洋水体细菌和生物量考查,并发表过数篇论文；从1984年起,中国开始独立组队进行南极考查,中国海洋微生物学家参加了相关考查活动；上世纪末,我们进行了中国首次北极考查,微生物研究涉足北极地域(50年代吴宝铃先生曾随前苏联学者赴北极作过考查),并发表过论文；中国南北极微生物考查研究结果为掌握极地微生物基本情况,及研究全球改变对该特定生态环境系统影响奠定了初步基础；本世纪初,中国学者又开始关注世界第三极—青藏高原微生物及其环境情况。中国极地微生物的研究进展专家讲座第1页（一）类别当前中国所取得南极微生物主要类别见表2。中国极地微生物调查研究主要结果

中国极地微生物的研究进展专家讲座第2页中国极地微生物的研究进展专家讲座第3页由该表可见,研究微生物以细菌为主,次为菌物(即真菌)。不完全统计表明所研究细菌大约有38属(种),丝状菌物6属,酵母8属(种),另外还有肠系细菌。不一样功效类型微生物包含固氮细菌、硝化细菌、石油烃降解菌、耐重金属菌、耐LPS菌、耐酸菌及卫生情况指示菌等等。南极微生物优势菌群：α、β-变性细菌群，噬纤维菌-黄杆菌-拟杆菌群（CFBgroup）。中国极地微生物的研究进展专家讲座第4页（二）极地生态环境与环境微生物学研究这方面研究主要将微生物置于整个生态系统中分析,如南极磷虾集群过程、集群区及磷虾本身微生物学研究，,在潮间带生态系统、食物链中作用,菲尔德斯半岛及附近区域生态系统中微生物多样性、生态结构特征、食物链及与生物/非生物因子间关系分析(吴宝铃等,1998)。中国极地微生物的研究进展专家讲座第5页（三）极地微生物开发利用研究1、抗冻物质冷适应微生物最显著特征便是含有相对低代谢速率，在长久生物进化过程中形成了一系列适应低温机制。这些机制包含营养物质吸收和转运、DNA复制合成、蛋白质合成、合成代谢和分解代谢正常进行、能量代谢正常进行、细胞分裂等。中国极地微生物的研究进展专家讲座第6页2、多不饱和脂肪酸(PolyUnsaturatedFattyAcids，PUFA)含有广泛而主要生物功效，这已经被越来越多人所认识。然而伴随PUFA开发应用领域扩大，来自于植物、哺乳动物和海洋鱼PUFA远远不能满足市场需求，微生物尤其是藻类、真菌能合成几乎全部PUFA并能在工业规模上培育而被视为有开发价值可替换生物资源。在南极细菌中含有多聚不饱和脂肪酸(PUEA)生成能力细菌所占百分比高于其在温带海洋细菌中百分比。中国极地微生物的研究进展专家讲座第7页3、抗紫外辐射物质在南极上空臭氧层最薄时厚度仅为平时50%，并出现了臭氧空洞，从而使UV一B总辐照度百分比增加uv一B对藻类伤害主要目标是藻细胞中分子中蛋白质、色素、DNA等，抑制光合作用、生长发育，甚至造成细胞死亡。为了防止或降低UV辐射，生活在高辐射环境下生物体形成了许多物理或者化学保护机制。Scytonemin、MAAs是两类抗辐射物质，假如提取这种化合物、了解其吸收紫外线机理，有望将其作为预防紫外线保护剂应用到化装品中。类胡萝卜素在保护细胞和生物体免受光、气体和感光色素等损伤中起主要作用。中国极地微生物的研究进展专家讲座第8页4、低温酶低温酶低温催化能力，低热稳定性使其在工业应用上有以下优势:经过温和热处理使低温酶失活，快速而经济地终止反应;生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，能够降低成本;生产过程便于监控。中国极地微生物的研究进展专家讲座第9页5、抗菌、抗肿瘤活性物质据统计，人们己经从微生物中发觉了8000各种含有抗菌和抗肿瘤活性天然产物。然而，从陆生微生物中新发觉生物活性物质种类正在降低，而且大部分是己知化合物。另首先，越来越多传染性病菌对传统抗生素逐步产生了抗药性，威胁人类健康三大疾病之一癌症也难以找到有效治疗药品，从而迫使生物学家寻找新天然生物活性物质来处理当前面临问题。所以，极地微生物因为含有独特生理机制而成为最有希望为人类提供产生含有生物活性新化合物微生物资源宝库之一中国极地微生物的研究进展专家讲座第10页传统环境微生物生态学研究方法采取计数、微生物培养及判定，生理生化分析等伎俩进行，这些方法在很大程度上依赖于微生物培养和纯种分离技术。纯培养极难，尤其是在南北极这么极端环境中。现有研究认为在自然界中仅有0.001%一1%微生物能够用现有技术伎俩进行人工培养。而且经过平板培养微生物有机体还有可能会偏离原来自然种群生理习性，甚至有可能偏离它们原来基因型组合。伴随各种分子生物学技术应用，使我们无须培养微生物，而直接经过对环境中遗传物质研究来到达目标，也为从分子水平上开展较为全方面、无偏差微生物生态学研究开辟了新路径。极端环境微生物分子研究方法及进展中国极地微生物的研究进展专家讲座第11页（一）从自然样品中直接提取核酸：从环境样品中提取核酸方法可分为两类，一是转移后裂解法，即先将微生物菌体与土壤颗粒分开，再提取DNA。另一类是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌体后提取DNA。相比之下，直接裂解法能够提取出沉积物样品中近乎全部微生物种群，且DNA产量大。在高效裂解细胞同时对己释放出DNA不予破坏是提升DNA产出率决定原因。当前己报道裂解法有碾磨法、超声波裂解法、液氮冻融法、变性剂热裂解法、酶解法等。需要提取DNA方法中国极地微生物的研究进展专家讲座第12页（二）分子生物学分析1.DNA熔解(解链)及复性分析该方法可应用于微生物群落结构分析。经过测定整个群落碱基组成和DNA复杂性可预计出总群落遗传结构及其复杂性。分析DNA熔解曲线能够得到碱基组成于G+C%。在限定条件下，测定溶液中剪切或热失活DNA复性动力学能够测定DNA序列复杂性。2.质粒指纹图谱分析:质粒大小和数目随物种不一样有所差异。质粒数是相对稳定,它可用来区分同一物种不一样菌株。3.低分子量RNA分布图这种方法为tRNA(75-90%个核苷酸)和5SrRNA(105-120个核苷酸)双相电泳分离。中国极地微生物的研究进展专家讲座第13页4.结合PCR一些技术：克隆文库分析法限制性片段长度多态性分析(RFLP)末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE)单链构象多态性分析(SSCP)随机引物扩增多态性分析(RAPD)将两种以上上述分子生物学方法结合利用。中国极地微生物的研究进展专家讲座第14页①克隆文库分析法主要步骤包含：(1)样品中总DNA提取；(2)建立16SrRNA基因克隆文库；(3)以限制性内切酶进行酶切筛选文库；(4)测序；(5)序列比较分析。中国极地微生物的研究进展专家讲座第15页②变性梯度凝胶电泳(DGGE)或者温度梯度凝胶电泳(TGGE)在含有连续变性剂梯度或者连续温度梯度凝胶中，加入双链PCR产物，依据PCR扩增产物中不一样G+C含量DNA组分在凝胶中移动速度不一样，直接反应DNA多态性。低G+C含量组分在凝胶中变性较快，在凝胶中移动速度较慢，高G+C含量DNA在凝胶中变性较慢，在凝胶中移动速度快，从而使不一样DNA在凝胶中位置不一样，产生不一样带。该项技术已经广泛应用于微生物生态学研究中，包含微生物群落多样性研究、环境改变对微生物群落影响研究比较不一样微环境微生物群落差异等。中国极地微生物的研究进展专家讲座第16页《南极中山站沉积物中微生物多样性分析及宏基因组文库研究》1.南极沉积物中微生物群落结构调查：DNA提取纯化、PCR扩增、DGGE、序列测定和系统计划关系分析。2.南极中山站排污入海口沉积物中微生物宏基因组文库构建和研究：沉积物中总DNA提取、大片段目标DNA筛选和回收、插入DNA片段末端补平、连接、体外包装。cosmid宏基因组文库保留和阳性克隆筛选、宏基因组文库评定、宏基因组文库中抗菌活性物质筛选、宏基因组文库中抗肿瘤活性物质筛选、宏基因组文库中酶活筛选。中国极地微生物的研究进展专家讲座第17页《北极深海沉积物中细菌多样性研究》对溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA进行了比较;并对沉积物宏基因组中16SrDNA基因PCR扩增相关引物序列、引物浓度、退火温度和模板稀释度等条件，以及PCR产物变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)聚丙烯酞胺凝胶浓度、变性剂浓度梯度进行了优化。中国极地微生物的研究进展专家讲座第18页1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mLTENP缓冲液(50mMTris，pH8.0，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA。2.沉积物宏基因组DNA纯化（腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除污染物，在PCR扩增时，极少许腐殖酸，就会抑制DNA聚合酶活性，干扰扩增结果）①电泳切胶回收②PEG8000纯化在上述粗提沉积物DNA溶液中加入20μL4MNaCl溶液与80μL13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置30min;10000r/min离心15mim搜集沉淀;用70%酒精洗沉淀后11000r/min离心l0min;用灭菌滤纸条干燥沉淀;加入40μLTEbuffer。中国极地微生物的研究进展专家讲座第19页3.16SrDNA基因PCR扩增4.16SrDNA基因PCR产物DGGE检测？5.优势条带回收及PCR扩增6.回收条带克隆7.感受态细胞制备8.PCR产物连接转化9.质粒DNA提取10.阳性克隆判定11.16SrDNAV3-V5区PCR扩增及DGGE再判定确定位置？12.测序，序列分析，建树中国极地微生物的研究进展专家讲座第20页DGGE变性剂浓度选择，电泳时间选择，染色方法选择电泳时间选择：采取了时间间歇(timetravel)方法，每隔一小时加一次样，最终依据图谱清楚分离度来确定出最适当时间。染色方法选择：EB染色后所显现条带要少一些（只能染双链DNA，不能染单链DNA），所以这种方法灵敏度要低一些。相较而言，银染法灵敏度就高了（因为它单双链DNA都能染色）。不过它无法顺利从条带中回收出DNA。因次在构建和观察指纹图谱时采取银染法。在要做回收克隆测序工作时，则采取EB染色。中国极地微生物的研究进展专家讲座第21页③限制性片段长度多态性分析(RFLP,RestrictionFragmentLengthPolymorphism)

RFLP技术基本原理是依据不一样生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不一样限制性片段，然后对这些特定DNA片段限制性内切酶产物进行分析。凡是能够引发酶切位点变异突变包含点突变(新产生和去除酶切位点)、基因插人或缺失(插入和缺失造成酶切位点间长度发生改变)等均可造成多态性产生。将PCR技术与RFLP分析相结合，用于研究环境中微生物多样性及群落分布，详细方法是采取特定引物，如16SrRNA基因通用引物对环境样品总基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物用不一样限制性内切酶酶切，经过电泳分析比较酶切带型，对特殊带型序列进行测定，进而了解该样品中所包含微生物序列信息。该方法广泛用于环境微生物多样性及其群落结构研究。中国极地微生物的研究进展专家讲座第22页末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP,TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism)T-RFLP技术与RFLP技术基本原理类似，不一样只是在其中一条PCR引物末端加上荧光标记，如TET(4,7,2,7-tetrachloro-6-carboxyfluorescein)，6-FAM(phosphoramiditefluorochrome5-carboxyfluorescein)等。在对目标基因如16SrRNA基因进行PCR扩增后一样采取不一样限制性内切酶进行酶切，产生不一样长度片段，电泳结果在测序仪上用基因扫描程序进行扫描，只有那些末端带有荧光标识片段能够被检测到。简化了图谱，就能够用来分析复杂微生物群落，以及能提供一些多样性信息，因为每一个可见条带都代表一个单个OTU或核糖体类型。经过这个图谱，能够计算种丰度，均度，以及样品之间相同性。这一技术能自动分析大量土壤样品，包含点样和分析。当前T-RFLP技术在微生物多样性及群落结构研究方面应用非常广泛。中国极地微生物的研究进展专家讲座第23页《东_西太平洋深海沉积物细菌多样性研究》采取土壤DNA快速提取试剂盒对样品DNA进行了提取→琼脂糖凝胶电泳检测→16SrRNA基因序列PCR扩增（用FAM标识引物27F（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和无标识引物926R（5‘-CCGTCAATTCATTTGAGT-3’）作为PCR扩增引物对）→PCR产物纯化与上样纯化（产物分别用HhaI和MspI两种限制性内切酶进行酶切，并于37℃过夜。酶切产物分别用乙醇沉淀浓缩（乙醇终浓度为70%）。浓缩后酶切产物用3100基因分析仪（ABI,USA）进行T-RFLP分析。Liz-500作为T-RFLP分析分子内标）→末端限制性片段（T-RFs）统计与聚类分析（每一个峰即代表一个末端限制性片段，而且统计数值采取二元统计（有峰计为1；无峰计为0），按照统计数值进行聚类分析，以分析研究不一样层位细菌群落结构。）中国极地微生物的研究进展专家讲座第24页16SrRNA基因文库构建及序列分析感受态细胞制备→细菌16SrRNA基因片断扩增→PCR产物纯化与连接→重组载体转化→扩增16SrRNA基因基因限制性酶切分析用水煮法快速提取细胞中基因组DNA，用特定引物进行PCR检测筛选克隆是否是阳性克隆以及插入片段大小是否正确，片断大小适当PCR产物分别用MspI和HhaI两种限制性内切酶进行酶切，酶切产物用4%琼脂糖凝胶进行电泳分析。依据酶切带型判断分类学单元（OTUs）多少。中国极地微生物的研究进展专家讲座第25页→多样性覆盖率分析与稀释曲线分析构建16SrRNA基因文库多样性覆盖百分率用公式：[1－(m/N)]×100计算，其中m是指每个16SrRNA基因文库中OTUs数目，N是指每个文库总克隆数。百分率越高表明文库多样性覆盖率越高。→16SrRNA基因测序及系统进化分析经过两对引物确定目标基因插入方向，从而确定测序引物中国极地微生物的研究进展专家讲座第26页当然仅仅依靠16SrDNA序列评定微生物多样性并不完全可靠，比如16SrDNA序列同源>98%，也可能是两个完全不一样菌属同时同种物种(古菌)也有可能相同性差异度到达5%。荧光原位杂交（FISH）：是一个不依赖于PCR分子生物学分析技术，能够较为准确快速和动态观察微生物种群改变，并同时提供形态数量和空间分布方面信息，同时能够克服核酸提取和PCR扩增过程中存在偏差。1.荧光显微镜2.流式细胞术（FlowCytometry,FCM）选择不一样单克隆抗体及荧光染料，能够利用流式细胞仪同时测定一个细胞上多个不一样特征，它能够高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检验相比，含有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进细胞定量分析技术。中国极地微生物的研究进展专家讲座第27页潜在问题：1.核酸回收过程中偏差，并非全部类群细胞都能同等有效裂解，另外，与核酸一起被提取出来腐殖质会干扰随即酶处理步骤。2.PCR及克隆过程中产生偏差，因为PCR对一些模板扩增含有有限性，从而造成对rRNA基因自然丰度预计会产生潜在偏差。可能见面临不一样物种基因序列相互集结形成聚合物危险，PCR技术还面临着污染问题。因为不一样细菌其染色体上rRNA基因操纵元拷贝数并不一样，从而依据特定rDNA克隆相对丰度来估算其对应种群相对丰度必定也会产生偏差。中国极地微生物的研究进展专家讲座第28页