土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座

一、课题背景1.尿素利用尿素是一个主要农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32.常见分解尿素微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，一些真菌和放线菌也能分解尿素。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第1页[该去哪里取样?][该配置怎样培养基?]2、方法：⑴造成有利于目标菌株生长环境⑵同时抑制大多数其它类型微生物阅读P21

筛选菌株1、土壤中取样。怎样分离能分解尿素细菌？土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第2页15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素③此配方培养基为何能够筛选出产生脲酶细菌?氮源是尿素，只允许能以尿素作为氮源微生物生长。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第3页1.利用尿素作为唯一氮源培养基分离出微生物①只是一个细菌吗？②都是能分解尿素微生物吗？2.请你提供一个方法，判断分解尿素细菌确实能将尿素分解成氨。4.怎样证实此培养基含有选择性呢？在以尿素为唯一氮源培养基中加入酚红指示剂（P26）土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第4页以尿素为唯一氮源培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有没有选择性试验组对照组培养基类型是否接种

目标

结果只生长尿素细菌生长各种微生物（菌落数显著多于试验组）是土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第5页怎样统计每克土壤样品中终究含有多少这么细菌？计数法显微镜直接计数法稀释涂布平板法比浊法膜过滤法土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第6页1.显微镜直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物数量。此法缺点是不能区分死菌和活菌。每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第7页2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成一个菌落是由一个单细胞繁殖而成，即一个菌落代表原先一个单细胞。⑵惯用方法：稀释涂布平板法。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第8页每克样品中菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液体积(ml)，M代表稀释倍数。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第9页某同学在稀释倍数为106

培养基中测得平板上菌落数平均数为234，那么每克样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第10页稀释涂布平板注意事项①为了确保结果准确，普通选择菌落数在30——300平板上进行计数。②为使结果靠近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上培养皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计菌落往往比活菌实际数目低。关键：恰当稀释度土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第11页假如106稀释度下三个重复组菌落数分别为1个、50个、170个。应怎样处理这个稀释组数据？◆假如得到了2个或2个以上菌落数目在30——300平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准确，需要重新试验。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第12页106第一天结束时1号培养皿372号培养皿403号培养皿32在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时统计作为结果，以预防因培养时间不足而造成遗漏菌落数目。此统计是否完整？P22统计菌落数土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第13页A同学从对应106倍稀释培养基中筛选出大约150个菌落，不过其它同学在一样稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不一样，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其它含氮物质)怎样证实A同学制作培养基确实被污染了？怎样证实A同学操作有问题？土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第14页方案一：由其它同学用与A同学相同土样进行试验方案二：将A同学配制培养基在不加土样情况下进行培养，作为空白对照，以证实培养基是否受到污染。结果预测：假如结果与A同学一致，则证实A无误；假如结果不一样，则证实A同学存在操作失误或培养基配制有问题。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第15页试验设计土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第16页[一]土壤取样◆取土样用小铁铲和盛土样信封灭菌。①准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。

②稀释相同倍数菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长菌落数目应显著多于选择培养基上数目，所以，牛肉膏蛋白胨培养基能够作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。[二]制备培养基

土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第17页◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不一样微生物采取不一样稀释度（三）样品稀释（四）取样涂布土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第18页（五）微生物培养与观察培养不一样微生物往往需要不一样培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃温度下培养3～4d。土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第19页某细菌固体培养基组成成份是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是＿＿＿＿＿＿＿，碳源是＿＿＿＿＿＿＿，氮源是＿＿＿＿＿＿＿。已知只有能合成脲酶细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于＿＿＿＿培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养细菌属于＿＿＿＿。琼脂

葡萄糖尿素选择异养型土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第20页在微生物群体生长规律测定中，种内斗争最显著最激烈时期是

A．调整期B．对数期

C．稳定时D．衰亡期答案：C土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第21页1.对细菌群体生长规律测定正确表述是（）A.在液体培养基上进行B.最少接种一个细菌C.接种一个细菌D.及时补充消耗营养物质2.使用选择培养基目标是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要微生物大量繁殖D.表现某微生物特定性状与其它微生物加以区分3.能合成脲酶微生物所需要碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素A

CD土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第22页4.以下说法不正确是（）A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度5个平板菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数预计值C.设置对照试验主要目标是排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度D.同其它生物环境相比，土壤中微生物数量最大，种类最多。B土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第23页5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入A.较多氮源物质B.较多碳源物质 C.青霉素类药品D.高浓度食盐C土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第24页常见选择培养方法1、在培养基中加入某种物质（1）青霉素分离酵母菌和霉菌(2)高浓度食盐金黄色葡萄球菌2、改变培养基营养成份（1）缺乏氮源固氮微生物（2）含无机碳源自养微生物(3)石油作为唯一碳源能消除石油污染微生物3、改变微生物培养条件（1）高温耐高温微生物（2）无氧厌氧型、兼性厌氧型土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第25页课题3分解纤维素微生物分离土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第26页

是自然界中纤维素含量最高天然产物。1.纤维素与纤维素酶纤维素是地球上含量最丰富

。多糖类物质棉花一基础知识纤维素酶是一个复合酶，普通认为它最少包含三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第27页土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第28页2.纤维素分解菌筛选①筛选纤维素分解菌方法是_____________。该方法能够经过_______反应直接筛选。刚果红染色法颜色②其原理是：刚果红能够与纤维素形成____________，当纤维素被__________分解后，红色复合物无法形成，出现以____________为中心_________，我们能够经过______________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌

透明圈是否产生透明圈土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第29页刚果红能与哪项物质形成红色复合物A．纤维二糖B．纤维素

C．葡萄糖D．麦芽糖土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第30页1.以下关于纤维素酶说法，错误是A.纤维素酶是一个复合酶，最少包含三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法能够筛选出纤维素分解菌，以下说法错误是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第31页土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到判别纤维素分解菌培养基上挑选产生透明圈菌落本试验流程与尿素分解菌分离试验流程有哪些异同？土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第32页选择培养1.选择培养目标：增加纤维素分解菌浓度，以确保能够从样品中分离到所需要微生物2.制备选择培养基参考书本29页旁栏a.旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？b.这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，是怎样进行选择？c.你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照选择培养时应将锥形瓶固定在A．桌子上B．温箱里

C．窗台上D．摇床土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第33页二、试验操作土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到判别纤维素分解菌培养基上挑选产生透明圈菌落按照课题1稀释操作方法，将选择培养后培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106参考书本刚果红染色法，挑选产生透明圈菌落，普通即为分解纤维素菌落土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第34页使用刚果红染色法时，加入刚果红时机是：①制备培养基时

②梯度稀释时

③倒平板时

④涂布时

⑤培养基上长出菌落时

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤C土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第35页练一练1.在富含纤维素环境中寻找纤维素分解菌，符合以下哪一生物学观点？A.生物结构与功效相适应观点B.生物结构与功效整体性观点C.生物与环境相适应观点D.生物发展进化观点C土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第36页2.从土壤中分离取得某种微生物步骤是①土壤取样②梯度稀释③选择培养④菌悬液涂布平板⑤挑选出单个菌落A.①②③④⑤B.①③②④⑤C.①②④③⑤D.①④②③⑤B土壤中分解尿素纤维素的细菌的分离与计数专家讲座第37页3.相关选择培养正确叙述是A.能够增加纤维素分解菌浓度B.能够降低纤维素分解菌浓度C.所用培养基是固体