动物细胞培养的应用

动物细胞培养的应用动物细胞培养的应用第1页表1动物细胞培养产物

疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等

动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调整剂β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等动物细胞培养的应用第2页表2微生物和动物细胞培养方法比较微生物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时—几天几天—3、4周对水纯度要求较低很高

与微生物细胞培养类似，动物细胞体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞能够采取与微生物培养类似方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷固体或半固体表面上生长。动物细胞培养的应用第3页5、动物细胞大规模培养工艺

大规模动物细胞培养工艺流程如图11-15所表示。工艺过程中，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质酶处理而得到单个细胞，再用离心法搜集细胞。将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩充培养，将培养所得细胞“种子”冷藏于液氮中，从液氮中取出一个别细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩充培养以取得足够细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物不一样形式进行产物分离纯化。对于积累在细胞内产物，可经过搜集细胞后进行破胞，再经过分离纯化取得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，能够经过浓缩、纯化培养液来取得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到产物细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，搜集细胞，再经分离纯化得到产物。动物细胞培养的应用第4页图11-15大规模动物细胞培养工艺流程图细胞培养反应器提取细胞诱生剂细胞产品（肿瘤抗原）纯化产品（干扰素）纯化提取产品（单克隆抗体）浓缩纯化79865432110动物细胞培养的应用第5页内容（一）单克隆抗体

哺乳动物细胞中有一套复杂防御系统保护自己不受有毒物质和病原物侵害，其中一个别防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异蛋白，这些蛋白能够在其它免疫系统蛋白帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功效。这些特异蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发觉，它们存在于人和脊椎动物血清之中，是这些生物体内免疫系统主要组成成份。因为抗体分子含有极其准确结合特异性，能够识别各种不一样抗原，还能够激活细胞其它防卫系统以毁灭抗原，所以抗体在基础研究和临床诊疗中取得了广泛重视和应用。伴随杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越辽阔应用前景。动物细胞培养的应用第6页抗体

由B细胞产生免疫球蛋白，它能识别抗原某一特定位点。抗体分子由两个完全相同重链分子以及两个完全相同轻链分子组成。存在于人或哺乳动物血清之中。抗原

指诱导产生抗体物质。

如前所述，抗体分子是免疫系统反应一个主要组分，因为抗体分子能够识别各种不一样外来抗原，同时可激活宿主防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一个单个抗体，这些抗体能够高度特异地识别免疫抗原特定区域，也就是抗原决定簇。因为一个抗原通常都有几个不一样抗原决定簇，所以每个免疫淋巴细胞都可能产生一个针对某一个抗原决定簇抗体，这些由同一抗原而产生不一样抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入抗体2抗体1动物细胞培养的应用第7页

于是，大家认识到要把抗体应用于临床诊疗或是治疗，必须要制备单一类型只对某一特定抗原决定簇抗体分子，也就是单克隆抗体。多克隆抗体

在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不一样抗原决定簇各种抗体。单克隆抗体

由杂交瘤细胞系产生针对某一特定抗原决定簇单一类型抗体。动物细胞培养的应用第8页补充

要依据糖基化结构，选择适宜细胞系糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜细胞系。动物细胞培养的应用第9页细胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠杂交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴细胞++000++0++人垂体++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠杂交瘤++000+++0动物细胞培养的应用第10页动物细胞制药表示系统与特征

昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、主要表示活性外源蛋白有效系统，应用于药品蛋白质表示。

一、哺乳动物细胞表示系统与特征1.动物细胞特征细胞膜、细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功效独特。内容（二）动物细胞培养的应用第11页2．哺乳动物细胞株系CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离上皮样细胞系，贴壁型生长，是当前使用最为普遍和成熟表示糖基化蛋白药品宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表示外源蛋白，而内源蛋白分泌极少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高忍受能力。蛋白质翻译后修饰准确，表示产物结构、性质和生物活性靠近天然。有各种衍生突变株应用于药品生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺点株表示药品有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因拷贝数，提升蛋白质表示水平。动物细胞培养的应用第12页BHK－21：幼仓鼠肾脏中分离成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表示重组凝血因子Ⅷ已被获准上市。C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离取得上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表示各种外源基因，其中EPO水平达10mg/L，生产rhGH已被同意上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养物中分离建立连续细胞系，能大量表示外源蛋白，广泛用于药品毒理学研究。骨髓瘤细胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞，分泌IgA，用于转染研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。动物细胞培养的应用第13页杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合细胞中分离取得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，轻易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表示。很多杂交瘤细胞系用于抗体制备。Vero：从成年非洲绿猴肾中分离取得贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已经有突变细胞系能用无血清培养。最为常见VeroE6增殖各种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被同意用于人体。也可作为转染宿主细胞，用于表示外源基因蛋白质药品和病毒检测。COS：是从SV40DNA转化非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到，广泛用于外源基因瞬时表示研究。GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗研究。动物细胞培养的应用第14页3．昆虫细胞株系Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，轻易放大，高效表示外源基因。Sf9：从秋粘虫卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常见昆虫表示细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表示外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表示重组蛋白能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。动物细胞培养的应用第15页三、细胞转染转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞技术通用名称。基因导入真核细胞方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导转化。方法表示类型毒性细胞类型特点基因枪瞬时，稳定无各种细胞组织，器官有效，仪器操作显微注射瞬时，稳定无各种细胞有效，技术难度大电穿孔瞬时，稳定无各种细胞有效，仪器操作冲击波瞬时，稳定无各种细胞，局部组织简单有效，仪器操作动物细胞培养的应用第16页方法表示类型毒性细胞类型特点逆转录病毒瞬时，稳定无对应宿主细胞有效原生质体融合瞬时，稳定无悬浮细胞技术复杂生物转染特点动物细胞培养的应用第17页化学转染是最常见转染方法。其基础原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）－葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，经过细胞内吞作用进入细胞。磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷DEAE－葡聚糖与带负电荷DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒商业化供给，尤其是脂质体材料转染试剂。影响原因：细胞培养物密度、DNA大小、纯度与用量、化学试剂用量与处理时间、促进剂使用等。动物细胞培养的应用第18页方法表示类型毒性细胞类型特点磷酸钙瞬时、稳定无贴壁细胞，悬浮细胞简单DEAE-葡聚糖瞬时有CV1，COS简单阳离子树脂瞬时、稳定有或无贴壁、原代悬浮细胞简单，有效化学转染特点动物细胞培养的应用第19页四、转染体筛选与分离转染后1～6天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因瞬时表示。为了取得稳定整合细胞系，先在非选择性培养基上培养24～48小时，让细胞倍增1～2代，使转染DNA表示。再按1：15百分比转移到选择性培养基上，每2～4天更换培养基，连续2～3周，促进抗性细胞生长，去除死细胞残骸，最终得到独立克隆。在转染中大约有万分之一细胞将稳定整合外源基因，所以需要显性选择标识来分离转染细胞。哺乳动物细胞选择标识，使用与之相对应选择剂。

动物细胞培养的应用第20页选择剂基因使用浓度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脱氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml杀瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙酰基转移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada