3.2基因工程的基本操作程序（第(1)课时）高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章

基因工程第2节

基因工程的基本操作程序（第一课时）从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建(核心)3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定一、目的基因的筛选与获取（一）目的基因1.概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。2.作用根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。3.实例与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉用到的目的基因Bt抗虫蛋白基因简称

Bt基因（二）筛选合适的目的基因1.较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.认识基因结构和功能的技术方法随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。01目的基因的筛选与获取3.实例：Bt

抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关不仅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取①通过构建基因文库来获取目的基因②人工合成目的基因③利用PCR特异性地快速扩增目的基因前提：方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成（三）获取目的基因的方法PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。

如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。一、目的基因的筛选与获取（四）利用PCR获取和扩增目的基因：DNA半保留复制原理

体外操作环境对目的基因的核苷酸序列进行大量复制目的可在短时间内大量扩增目的基因优点聚合酶链式反应全称它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR一、目的基因的筛选与获取（四）利用PCR获取和扩增目的基因：【重温】DNA复制的过程解旋合成子链形成新DNACGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子链CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸为什么子链的延伸方向是5′→3′？因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链，只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端为什么子链合成需要引物？CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子01一、目的因的筛选与获取问题:结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链合成DNA子链的原料催化合成DNA子链引物提供DNA复制的模板断开氢键，打开DNA双链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用高温代替）4种脱氧核苷酸DNA聚合酶01耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA母链引物（2种）稳定的缓冲溶液四种脱氧核苷酸(dNTP)1.基本条件:一般添加Mg2+（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸长度通常为20~30个核苷酸模板、原料、能量、酶、引物、缓冲溶液、不同温度一、目的基因的筛选与获取（四）利用PCR获取和扩增目的基因：2.PCR反应过程耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。2.PCR反应过程因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。905072℃变性3`5`5`3`2.PCR反应过程905072℃复性2.PCR反应过程905072℃延伸2.PCR反应过程905072℃变性2.PCR反应过程905072℃复性2.PCR反应过程905072℃延伸2.PCR反应过程905072℃变性2.PCR反应过程905072℃复性2.PCR反应过程905072℃延伸2.PCR反应过程3.PCR的结果：由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2n4.PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程一、目的基因的筛选与获取（四）利用PCR获取和扩增目的基因：PCR中的数量关系扩增次数123nDNA片段数2482n含引物的DNA片段数2482n含其中一种引物的DNA片段数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA片段数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脱氧核苷酸链等长的DNA片段数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR技术与DNA复制过程比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应

（

）（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚

（

）（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温

（

）（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高

（

）判断常考语句，澄清易混易错问题：获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？二、基因表达载体的构建人们所需要的基因作用：便于重组DNA分子的筛选位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片段）终止转录位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。基因工程的核心1.目的：2.组成：问题:目的基因该插入什么位置？目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。启动子终止子起始密码子终止密码子位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点(本身不转录)决定氨基酸不决定氨基酸对比启动子起始密码子终止子终止密码子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。翻译的起始点AUG(甲硫氨酸）GUG（缬氨酸）转录的终点翻译的终点（UAA、UGA、UAG)问题:辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。3.构建过程：质粒限制酶限制酶切割位点首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；01限制酶限制酶切割位点获取目的基因目的基因然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段023.构建过程：DNA连接酶重组DNA分子获取目的基因质粒利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。033.构建过程：质粒限制酶限制酶DNA连接酶同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割重组DNA分子限制酶切割位点目的基因限制酶切割位点获取目的基因思考：使用一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？3.构建过程：1、单酶切（同一种酶）：（1）目的（结果）：产生相同的黏性末端（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：①目的基因——载体连接物②载体——载体连接物（弊端）③目的基因——目的基因连接物（弊端）②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化启动子方向目的基因转录方向限制酶切割abcdDNA连接