核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第1页核酸分子杂交技术：

具一定同源性两条(DNA或RNA)单链在适宜温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对标准特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)核酸分子杂交技术第2页主要内容第一节分子杂交技术理论基础第二节核酸分子杂交方法第三节核酸杂交探针

核酸分子杂交技术第3页核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院（CarnegieInstituteofWashington）RoyBritten

及其同事创造第一节分子杂交技术理论基础核酸分子杂交技术第4页变性复性DNA-DNA杂交双链分子关键步骤：变性—杂交（复性）--检测信号—结论

信号采集与处理结论核酸分子杂交技术第5页

一、DNA变性与复性

（一）DNA变性

1、定义：一些理化原因造成两条DNA链间

氢链断裂变为单链过程，称DNA变性核酸分子杂交技术第6页2、变性方法：

1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间氢键完全断裂。

2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间氢键断裂。

3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间氢键断裂核酸分子杂交技术第7页3、核酸溶液变性后理化性质改变：

粘度降低密度增加紫外吸收值增加

(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收改变追踪变性过程)核酸分子杂交技术第8页4、DNA变性曲线

AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当到达一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开变性DNA/总DNATm值：50%DNA分子发生变性温度（即熔解曲线中点对应温度），这一现象和结晶融解相类似，故又称融点或融解温度（meltingtemperature,Tm）Tm是指消光值上升到最大消光值二分之一时温度核酸分子杂交技术第9页5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3Tm不是一个固定数值，它与很多原因相关：pH值、离子强度和DNA碱基百分比DNA制剂不应保留在离子强度过低溶液中，普通保留在1mol/lNaCl溶液中较稳定核酸分子杂交技术第10页（二）复性

1、定义：变性单链核酸分子在一定条件下按碱基互补标准重新结合为双链核酸过程，称复性或杂交。含有互补序列两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。核酸分子杂交技术第11页2、复性过程1）单链分子间碰撞形成局部双链2）局部双链周围碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围碱基如配对，则形成中心序列3）形成完整双链分子核酸分子杂交技术第12页3、复性速率方程（服从二级反应动力学）dCdt=K2C2（1）将（1）积分CCo11+K2Cot=（2）二分之一单链DNA分子复性时，（2）式中为121211+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=核酸分子杂交技术第13页

二、影响杂交原因

1、核酸分子浓度和长度：

浓度越大，复性速度越快

分子越大，复性速度越慢

单链探针，浓度增加，杂交效率增加

双链探针，浓度控制在0.1-0.5μg,

浓度过高影响杂交效率核酸分子杂交技术第14页2、温度：

（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃

（2）RNA/DNA

或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值

（原位杂交时，杂交液中加入适量甲酰胺，可防止因杂交温度过高而引发组织形态结构破坏以及标本脱落）

（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃核酸分子杂交技术第15页3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，伴随盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度盐使碱基错配杂交体更稳定（当进行序列不完全同源核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高盐浓度和洗膜溶液盐浓度）

核酸分子杂交技术第16页4、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交Tm值，能降低杂交液温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定（1）当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交

核酸分子杂交技术第17页5、核酸分子复杂性：（1）核酸复杂性是指存在于反应体系中不一样次序总长度，Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比

（Cot1/2值越大，复性速度越慢）（2）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后相对杂交率取决于DNA相对复杂性核酸分子杂交技术第18页6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，降低其对探针非特异性吸附（2）常见封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉

核酸分子杂交技术第19页膜上印迹杂交原位杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法

第二节核酸分子杂交方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相杂交

液相杂交

核酸分子杂交技术第20页核酸分子杂交试验步骤：印迹转移：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上

主要三种方式：毛细管虹吸作用真空抽滤作用电场作用杂交：将含有核酸等样品印迹滤膜同带有放射性标识或其它标识DNA或RNA探针杂交核酸分子杂交技术第21页2、常见印迹转移方法（Southernblot）

1）毛细管虹吸印迹法

利用浓盐转移缓冲液推进作用，将凝胶中DNA转移到固相支持物上

核酸分子杂交技术第22页2）电转法利用电场电泳作用将凝胶中DNA转移到固相支持物上核酸分子杂交技术第23页3、同时带动凝胶中DNA片段垂直向上运动，凝胶中DNA片段移出凝胶而滞留在膜上1、转移缓冲液中含有高浓度NaCl和柠檬酸钠2、上层吸水纸虹吸作用使缓冲液经过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动核酸分子杂交技术第24页3）真空转移法

原理与毛细管虹吸法相同不一样点：滤膜在下，凝胶在上方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中经过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面尼龙膜或硝酸纤维素膜上核酸分子杂交技术第25页SouthernDNA印迹杂交EdwinMellorSouthern核酸分子杂交技术第26页SouthernDNA印迹杂交

使在电泳凝胶中分离DNA片段转移并结合在适当滤膜上，然后经过同标识单链DNA或RNA探针杂交作用检测这些被转移DNA片段。E.Southern于1975年首先设计出来，故又称：Southernblot

核酸分子杂交技术第27页Southern印迹杂交主要流程1）待测核酸样品制备

1、裂解或破碎细胞

2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不一样DNA片段核酸分子杂交技术第28页2）待测DNA样品电泳分离1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶含有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同分子处于同一条带

3、分子量标准：经HindⅢ消化λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标识

核酸分子杂交技术第29页3）凝胶中核酸变性（碱改变）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性为较短单链DNA,

然后置于中性缓冲液或者凝胶缓冲液之中核酸分子杂交技术第30页4）Southern印迹指将电泳分离DNA片段转移到一定固相支持物上过程核酸分子杂交技术第31页理想固相支持物应具备特征①含有较强结合核酸分子能力②不影响与探针杂交反应③与核酸分子结合稳定牢靠④含有良好机械性能非特异吸附少核酸分子杂交技术第32页常见固相支持物(滤膜)尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE）特点：进行核酸杂交时，滤膜轻易操作和保留（与凝胶相比）核酸分子杂交技术第33页核酸分子杂交技术第34页滤膜选择核酸特殊性、分子大小杂交过程中所包括步骤多寡及敏感性等参数硝酸纤维素滤膜：不能滞留小于150bpDNA片段不能同RNA结合

广泛变性后RNA很轻易转移到硝酸纤维素滤膜（P.S.Thomas,1983）改变缓冲液能够改进硝酸纤维素滤膜对小片段DNA滞留能力

(G.E.Smith,1980:1mmol/LCH3COONH4和0.2mmol/LNaOH缓冲液代替SSC)核酸分子杂交技术第35页尼龙滤膜较为理想固相支持物结合核酸能力强转膜后可屡次重复使用（每次杂交探针能够洗去而结合DNA酶切片段不轻易被洗去）缺点：杂交信号本底较高核酸分子杂交技术第36页5）Southern杂交

1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合位点

预杂交液为不含DNA探针杂交液

2、杂交：液相中DNA探针与膜上待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交

3、洗膜：去除游离放射性探针或非特异结合DNA核酸分子杂交技术第37页6）杂交信号检测

1、放射自显影：适合用于放射性核素标识探针

2、比色或化学发光检测：适于非核素标识探针核酸分子杂交技术第38页SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料1%琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标识玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现阳性条带，表明含有水稻psbA基因序列核酸分子杂交技术第39页利用非放射性探针检测核苷酸生物素（biotin）--抗生物素蛋白（avidin）抗生物素蛋白核酸分子杂交技术第40页（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交基因DNA片段X光底片Southernblot

操作流程核酸分子杂交技术第41页7）Southern杂交应用

1、酶切图谱分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突变分析

4、限制性片段长度多态性分析核酸分子杂交技术第42页Northernblot核酸分子杂交技术第43页1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰活性滤纸上，进行核酸杂交一个试验方法所以法与Southernblot杂交技术十分类似，故叫做Northernblotting

核酸分子杂交技术第44页Northern印迹杂交

1、基础原理和基础过程与Southernblot基础相同

2、判别RNA3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNA核酸分子杂交技术第45页Northern印迹与Southern印迹不一样点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，防止单链RNA本身形成高级结构和本身降解[变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)+RNase抑制环境]，DNA电泳前和电泳中不变性

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern

印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNA核酸分子杂交技术第46页Western印迹杂交

检测蛋白质经PAGE凝胶电泳并染色后，转移到滤膜上固定，然后用“抗原-抗体”免疫反应或“DNA-Protein”结合反应来判别滤膜上蛋白质用来分析样品中蛋白质种类及分子质量核酸分子杂交技术第47页Western印迹法步骤先将蛋白经过SDS电泳分离开来，再利用电场力作用将胶上蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上核酸分子杂交技术第48页斑点印迹杂交（dotblotting）

狭线印迹杂交（slotblotting）

更适于核酸样品定量检测原理与Southern杂交相同在试验过程中，使用特殊设计加样装置，使众多待检测样品能够一次同时转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵核酸分子杂交技术第49页斑点及狭缝印迹杂交特点

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、判别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能判别核酸分子量核酸分子杂交技术第50页原位杂交（insituhybridization）生长在培养基平板上菌落或噬菌斑是按照原来位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用1975年Grunstein和Hongess发展起来原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低靶序列有极高敏感性，在临床应用上有独特意义核酸分子杂交技术第51页原位杂交定义：将标识核酸探针与固定在细胞或组织中核酸进行杂交，称原位杂交依据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交依据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交核酸分子杂交技术第52页

保持组织细胞形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内定位不妨碍核酸与探针杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞固定

理想固定液应具备：核酸分子杂交技术第53页（2）组织细胞杂交前预处理

去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面蛋白质组织细胞内核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，防止细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落核酸分子杂交技术第54页（3）探针选择与标识

以取得最好杂交效果为依据选择探针探针长度普通为50~300bp,有时达1.5kb

放射性核素标识探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长非核素标识探针安全、稳定性好、显色快，易于观察核酸分子杂交技术第55页（4）杂交

杂交液体积小：10~20μlcDNA和RNA探针杂交温度约为50℃

杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜杂交前普通将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性冲洗温度普通不超出50℃核酸分子杂交技术第56页（5）杂交结果检测

所用探针为核素标识,放射自显影检测所用探针为非核素标识,比色或化学发光检测核酸分子杂交技术第57页液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子过程核酸分子杂交技术第58页（一）RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理

RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法核酸分子杂交技术第59页2、杂交过程

制备待测RNARNA探针制备与标识：体外转录法制备和标记RNA探针

杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交

RNaseA和RNaseTI除去单链RNA

电泳分离RNA

放射自显性检测杂交结果核酸分子杂交技术第60页（二）核酸酶S1保护分析法

1、原理核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法核酸分子杂交技术第61页2、杂交过程

制备待测RNA：总RNA或mRNA均可单链DNA探针制备与标识

杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交

核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA

电泳分离DNA/RNA杂交体分子放射自显影检测杂交结果核酸分子杂交技术第62页第三节核酸杂交探针

核酸分子杂交技术第63页化学及生物学意义上探针(probe)指与特定靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊方法探知分子

抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体相互作用每一个病原体都含有独特核酸片段，经过分离和标识这些片段就可制备出探针，用于疾病诊疗等研究核酸分子杂交技术第64页①同源或个别同源基因组DNA探针

②总cDNA探针和特异cDNA探针(诊疗试剂)③RNA探针④人工合成寡核苷酸探针

(检测点突变和小段碱基缺失或插入)一、常见探针类型：1、按起源及性质划分2、按标识物划分

①放射性标识探针②非放射性标识探针核酸分子杂交技术第65页二、标识物

理想标识物应具备特征：

高度灵敏性不影响碱基配正确特异性不影响探针分子主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法含有高度灵敏性和高度特异性核酸分子杂交技术第66页1、放射性标识探针用放射性同位素做为标识物。放射性同位素是最早使用，也是当前应用最广泛探针标识物。常见同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍优点：灵敏度高，能够检测到Pg级；缺点：辐射危害（易造成放射性污染）同位素半衰期限制32P高放射性半衰期14.3d35S放射性较弱半衰期87.1d3H放射性弱半衰期12.35y

核酸分子杂交技术第67页2、非放射性标识物光密度或电子密度标识物：金、银、Hg半抗原：生物素（Biotin）、地高辛（digoxigenin）配体：生物素是亲和素配体荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（TRITC）化学发光探针：标识物与某种底物反应发光，

如：生物素酰化碱性磷酸酶（AKP）可使发光底物发光

辣根过氧化物酶（HRP）

核酸分子杂交技术第68页Biotin（生物素）Avidin抗生物素蛋白生物素是一个小分子水溶性维生素，对亲和素有独特亲和力，二者能形成稳定复合物，经过连接在亲和素或抗生物素蛋白上显色物质(如酶、荧光素等)进行检测核酸分子杂交技术第69页地高辛是一个类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素检测。地高辛标识核酸探针检测灵敏度可与放射性同位素标识相当，而特异性优于生物素标识，其应用日趋广泛核酸分子杂交技术第70页三、标识方法体内标识法：将核素标识化合物作为合成代谢底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中

核酸分子杂交技术第71页体外标识法：

化学标识法：标识物分子上活性基因与探针分子上一些基因反应，标识物直接结合到探针分子上

酶促标识法：标识物预先标识核苷酸，然后利用酶促法将标识核苷酸掺入到探针上核酸分子杂交技术第72页酶促标识法①切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5

末端逐步切除3、在DNA聚合酶I53聚合酶催化下，以互补DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口3末端-OH上，合成新DNA链，同时将标识核苷酸掺入到新DNA链中核酸分子杂交技术第73页切口平移法(nicktranslationlabeling)5’5’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’DNA酶IDNA聚合酶I+标识dNTP5’3’变性探针平均长度600bp核酸分子杂交技术第74页②随机引物法原理:随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链引物，在DNA聚合酶催化下，按53方向合成一新DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板一样合成一条新完全互补DNA链。合成时，带放射性核素标识核苷酸掺入到新合成DNA分子中核酸分子杂交技术第75页随机引物法(randomprimedDNAlabeling)5’3’5’3’5’3’5’3’随机6-12bp单核苷酸引物变性普通探针长度在400-600bp之间核酸分子杂交技术第76页随机引物法优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针标识2、操作简单方便，防止因DNaseI处理浓度掌握不妥所带来一系列问题3、标识活性高，