抗菌性银纳米粒子-壳聚糖-溶菌酶复合物的设计和实现 高分子材料学专业

目录16425_WPSOffice_Level1摘要 125306_WPSOffice_Level1Abstract 216508_WPSOffice_Level1第一章绪论 325306_WPSOffice_Level21.1银纳米粒子 325306_WPSOffice_Level31.1.1银纳米粒子的应用 316508_WPSOffice_Level31.1.2银纳米粒子的抗菌作用 525008_WPSOffice_Level31.1.3银纳米粒子的合成方法 716508_WPSOffice_Level21.2课题的提出 1015607_WPSOffice_Level31.2.1研究的目的及意义 1026345_WPSOffice_Level31.2.2研究内容和实验方法 1125008_WPSOffice_Level1第二章壳聚糖还原制备银纳米粒子合成表征及性质测试 1225008_WPSOffice_Level22.1引言 1215607_WPSOffice_Level22.2材料与试剂 1226345_WPSOffice_Level22.3实验仪器 133184_WPSOffice_Level22.4银纳米粒子的合成 1428081_WPSOffice_Level22.5适合银纳米粒子的选择实验 1424736_WPSOffice_Level22.6银纳米粒子粒度表征 1424370_WPSOffice_Level22.7银纳米粒子的抑菌实验 1419212_WPSOffice_Level22.8银纳米粒子对于细胞毒性的测试 1518363_WPSOffice_Level22.9不同浓度的银纳米粒子结合溶菌酶后的抑菌实验 1515607_WPSOffice_Level1第三章结果与讨论 1727687_WPSOffice_Level23.1银纳米粒子的紫外-可见吸收性质 1724042_WPSOffice_Level23.2银纳米粒子的形貌 188255_WPSOffice_Level23.3银纳米粒子的抑菌性质 1913393_WPSOffice_Level23.4银纳米粒子的细胞毒性 2116666_WPSOffice_Level23.5银纳米粒子结合溶菌酶的抑菌作用 2226345_WPSOffice_Level1第四章结论与展望 2528982_WPSOffice_Level24.1结论 252348_WPSOffice_Level24.2展望 253184_WPSOffice_Level1参考文献 2625576_WPSOffice_Level1致谢 29抗菌性银纳米粒子-壳聚糖-溶菌酶复合物的设计摘要银纳米粒子被广泛使用于很多领域，尤其是在抗菌领域。本论文研究了银纳米粒子与溶菌酶相结合的抗菌活性。在本实验中，首先制备了不同粒径的银纳米粒子。我们测试了不同粒径的银纳米粒子的紫外-可见吸收光谱；随后通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射仪（DLS）测量不同粒径的银纳米粒子表面形貌特征和粒径尺寸分布；我们将不同浓度的银纳米粒子与大肠杆菌（MG-1655）混合后涂布在琼脂板上，培养一段时间后观察板上的菌落数目以判断银纳米粒子的抗菌活性与浓度的相关关系。为了测量银纳米粒子的细胞毒性，我们使用CCK-8试剂检测了银纳米粒子对细胞活性的影响。最后，我们将溶菌酶和不同浓度的银纳米粒子结合起来，利用涂板法研究两种杀菌物质结合之后的杀菌效果。结果表明，银纳米粒子的抗菌活性和细胞毒性随着浓度的增加而增大。同时结合溶菌酶后的银纳米粒子的抗菌活性要高于单纯的银纳米粒子，溶菌酶能够显著提高银纳米粒子的抗菌活性。关键词：银纳米粒子；抗菌；细胞毒性；溶菌酶Designofantibacterialsilvernanoparticles-chitosan-lysozymecomplexAbstractSilvernanoparticlesarewidelyusedinmanyfields,especiallyinthefieldofantibacterial.Theantibacterialactivityofsilvernanoparticlescombinedwithlysozymewasstudiedinthispaper.Inthisexperiment,firstofall,wepreparedsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizes.WetestedtheUV-Visabsorptionspectraofsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizes.Subsequently,thesurfacemorphologyandparticlesizedistributionofsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizesweremeasuredbytransmissionelectronmicroscopy(TEM)anddynamiclightscattering(DLS).WemixeddifferentconcentrationsofsilvernanoparticleswithE.coli(MG-1655)andcoatedthemonagarplates.Afterincubationforaperiodoftime,observethenumberofcoloniesontheplatetodeterminetherelationshipbetweenantibacterialactivityandconcentrationofsilvernanoparticles.Inordertomeasurethecytotoxicityofsilvernanoparticles,weusedCCK-8reagenttoexamintheeffectofsilvernanoparticlesoncellviability.Atlast,wecombinedlysozymewithdifferentconcentrationsofsilvernanoparticlesandusedthecoatingmethodtostudythebactericidaleffectofthecombinationoftwobactericidalsubstances.Theresultsshowesthattheantibacterialactivityandcytotoxicityofsilvernanoparticlesincreasedwiththeincreasingconcentration.Atthesametime,theantibacterialactivityofsilvernanoparticlescombinedwithlysozymeishigherthanthatofpuresilvernanoparticlesthatdonotbindlysozyme.Lysozymecansignificantlyincreasetheantibacterialactivityofsilvernanoparticles.Keywords:Silvernanoparticles,antibacterial,cytotoxicity,lysozyme绪论1.1银纳米粒子纳米技术是21世纪的新兴技术，广泛应用于信息、生物、医药、化工、航空航天、能源和国防等的诸多领域[1]。银纳米粒子即尺寸在1-100nm之间的颗粒。由于其独特的小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应和量子尺寸效应等，成为这些年来研究的热点。而其中的银纳米粒子材料更是其中使用最广泛的纳米材料。到目前为止，银纳米粒子已经在纺织行业，电镀行业，防晒乳液，催化材料，电子产品等领域取得了长足的进步，但是人们最关心的还是银纳米粒子的抗菌作用[2]。在研究银纳米粒子的起初，研究者们发现了银纳米粒子对于细菌具有高强的杀伤力。随着研究的持续深入，人们发现壳聚糖由于其独特的阳离子效应，也具有一定的杀菌能力，并且由于壳聚糖具备绿色环保、可生物降解的优点使得人们开始思考如何将二者的优点结合起来制备更加优良的抗菌杀菌剂[3]。1.1.1银纳米粒子的应用到目前为止，由于银纳米粒子本身的出色性质，研究者们已经研究出很多种关于银纳米粒子的应用，其中包括医疗器械、高端银浆、催化材料、新能源、电镀行业等等。其中由于银纳米粒子是一种贵金属粒子，有的人就用到了这个特性。Yu等[4]用银纳米粒子单步法催化刻蚀太阳能电池的减反层结构，可以将太阳能电池的效率从8.25%提升到10%。下图1即单步法刻蚀硅表面的示意图。此方法中用银纳米粒子制备硅表面微纳结构，使得纳米减反层的反射率在光谱300nm至1100nm范围内降低了2%以下。大大提高了太阳能电池的效率。图1.单步法刻蚀硅表面。同时，除了作为贵金属粒子使用以外，有的人还发现银纳米粒子具有抗血小板作用和抗凝作用。例如麦麸木聚糖合成出的银纳米粒子具有较强的溶栓活性，可使血块溶解，细胞分散，如下图2所示。Shrivastava等[5]发现银纳米粒子能够显著减缓血栓中主要成分之一纤维蛋白的聚合，因为纳米粒子会与纤维蛋白合成复合物，阻止纤维蛋白聚合，从而能够产生较强的溶栓活性。图2.血块被用麦麸木聚糖作为稳定剂和还原剂合成的银纳米粒子处理前后的对照图。有关银修饰二氧化钛提高光催化活性的研究，也已经有许多的文献报道了。Wang等[6]通过对照实验研究了自制介孔二氧化钛和经银纳米粒子修饰过的二氧化钛对甲基橙紫外光催化降解性能。如下图3可见，银纳米粒子修饰过的二氧化钛的光催化性能显著增强。通过Wang等的研究发现，银纳米粒子的粒径越小，越有利于二氧化钛光催化活性的增高，这是因为附在二氧化钛表面的银的费米能级低于二氧化钛，能够有效的捕获二氧化钛产生的光生电子，使光生空穴向二氧化钛纳米粒子表面移动，提升了光生电子的量子产率，从而提高了二氧化钛的光催化性能。图3.不同样品对甲基橙的光催化效果。1.1.2银纳米粒子的抗菌作用但是银纳米粒子应用最广泛的用途是它的抗菌效应。在广袤的中国大地上，经常会出现某些神奇的水井有着包治百病的功效，而导致这个的原因便是银离子。通常，在地下河的通道中会出现银矿，银离子杀灭细菌，从而导致出现治病的效果。因此，古时候人们便把银用作抗菌材料，至今已有几百年的历史。最近，由于纳米材料的广泛应用，银纳米粒子也逐渐进入人们的视野中。银纳米粒子对于细菌也具有相当大的毒性。Feng等[7]用壳聚糖作为保护剂和分散剂，通过液相还原法制备了水溶性银纳米粒子（CS/AgNPs），并通过化学键负载于脱脂棉表面，制备了表面负载CS/AgNPs的抗菌棉纤维，然后通过通过琼脂板技术法，统计抗菌棉对于细菌的抑菌率，发现对于MRSA、E.coli抑菌率在99.8%以上,是一种强力且高效的抗菌棉，具有潜在的应用价值。银纳米粒子抗菌作用的机理尽管纳米级银对细菌活性的机制尚未完全阐明，但至今为止提出的三种最常见的产生毒性机理是：（1）游离银离子的吸收和ATP的产生和DNA复制的中断:Asharani等认为银纳米粒子会与O2和H2O反应生成银离子，银离子一直具有抗菌特性；同时银离子会与呼吸链反应中的NADH脱氢酶相互作用，导致ATP合成失败；此外，Ag+还会增加DNA在聚合酶链式反应中的突变频率，导致DNA复制中断。（2）银纳米粒子和银离子生成活性氧：已知活性氧自由基会攻击膜脂导致线粒体功能破坏或者DNA损伤，研究表明银纳米粒子会发生氧催化反应与谷胱甘肽相互作用，结合谷胱甘肽还原酶来抑制抗氧化防御，从而增加活性氧的产生。（3）银纳米粒子直接破坏细胞膜：其中一个假设是，纳米颗粒和细菌细胞之间的相互作用是由于带负电荷的细胞膜和带正电的纳米颗粒之间的静电吸引[2]。还有人提出，银纳米粒子和膜细胞的相互作用的优先位点可能是含硫蛋白质——以类似的方式，银与呼吸链蛋白的巯基和转运蛋白相互作用，影响其正常的生理功能。尽管银纳米粒子与细胞质膜相互作用并且能够穿透到细胞内的详细机理尚未完全确定，但是很明显的是附着于细胞膜上的银纳米粒子导致通透性增加，并且干扰其呼吸作用。银纳米材料和细菌细胞之间的各种观察和假设的相互作用在图4中得到了概念性的说明。图4.纳米银与细菌细胞的相互作用示意图。纳米银可能（1）释放银离子并产生活性氧;（2）与膜蛋白相互作用，影响其正常的生理功能;（3）积聚在细胞膜上，影响膜的通透性;（4）进入可以产生活性氧细胞内，释放银离子，影响DNA。产生的活性氧可能会影响DNA，细胞膜和膜蛋白，并且银离子释放可能影响DNA和膜蛋白[8][9]。银纳米粒子与蛋白质的结合形式随着纳米技术的快速发展，纳米粒子与蛋白质结合相关的研究也越来越受到人们的广泛关注。因为一方面，蛋白质可以授予纳米粒子更高的稳定性和更丰富的生物活性；另一方面，纳米粒子可以调控蛋白质的反应，制造出功能更加多样化的蛋白质。银纳米粒子与蛋白质的结合形式一般可以分为四种[10]。它们分别是（1）静电吸引，即带电荷的蛋白质与银纳米粒子表面配体发生静电相互作用使其结合在一起。Rotello等[11]通过纳米粒子末端配体的电荷性质，将细胞色素C的特定位点靶向的结合在纳米粒子表面，这就是利用了静电吸引作用。（2）与银纳米粒子配体共价结合，除了与银纳米粒子的静电吸引相互结合以外，还可以使得银纳米粒子配体与蛋白质发生共价结合。这种方法一般被用作纳米粒子表面化学的极端修饰，例如Hainfeld等[12]利用高效液相色谱精确分离带有一个反应基团的金纳米粒子，通过此方法能够很好的限制蛋白质在纳米粒子表面的覆盖率。（3）与蛋白质上辅因子特异性结合，辅因子功能化的银纳米粒子能有效的与相应的蛋白质发生特异性结合，例如生物素与链霉亲合素的亲合性相互作用被广泛应用于生物活性纳米粒子系统的构建。（4）直接与纳米粒子表面结合，银纳米粒子还可以直接与蛋白质上的基团结合形成复合物，但是纳米粒子表面的空间位阻效应将会是表面结合的关键问题。如果表面配体过多或者过长，那么目标的蛋白质残基将会很难与粒子表面接触，从而结合在一起。如下图所示。图5.蛋白质与纳米粒子结合示意图：（a）静电吸附，（b）与纳米粒子配体共价结合，（c）与蛋白质上辅因子特异性结合，（d）直接与纳米粒子表面结合。1.1.3银纳米粒子的合成方法制备银纳米粒子的合成方法很多。大致分为物理法和化学法[13][14]。物理法是使用物理手段粉碎粒子从而得到纳米粒子，其中包括激光烧蚀法、机械球磨法、电子束照射法等。虽然物理法制备银纳米粒子原理简单，但是对于设备及仪器的要求比较高，价格昂贵。同时，得到的银纳米粒子的尺寸与形状难以控制，比较适合于简单的纳米粒子的制备，对于要求精准的实验还是需要化学方法来制备银纳米粒子[15][16]。传统的化学方法有银化合物分解法、电化学还原法、液相还原法、光化学还原法等，可生产出大量的大小形状可控的银纳米粒子，制备工艺比较简单且对于设备的要求不高，价格低廉[16][17][18]。在化学法制备银纳米粒子时，为了防止纳米粒子团聚，得到粒径粒径可控的银纳米粒子颗粒，通常需要加入一定量的保护剂或者分散剂。化学还原法制备单分散银纳米粒子Xing等[19]以聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，水合肼为还原剂，AgN03溶液为银源,采用化学还原法制备单分散的银纳米粒子，它们的粒径分布均匀。Xing在常温下称量聚维酮（PVP）粉末，然后加入20mL蒸馏水，磁力搅拌使其完全溶解，然后加入一定量的质量分数为1%的AgNO3溶液，补充蒸馏水使其总体积达到45mL，继续搅拌30min。接着量取一定量的水合肼溶液，加入一定量的蒸馏水使其总体积达到20mL，将水合肼溶液在1min内快速均匀的滴加到PVP-AgN03混合溶液中，在恒定温度下反应1h，最终得到银纳米粒子溶胶。在溶胶中加入一定量的无水乙醇后，放入高速旋转的离心机中，沉淀物用乙醇和丙酮洗涤三次后干燥，即可得到纳米银粉末。图6即银纳米粒子的TEM图。图6.银纳米粒子的TEM图和高分辨率透射电镜图。溶剂热还原法制备银纳米粒子制备银纳米粒子的方法很多，还可以使用溶剂热还原法制备银纳米粒子。Wang等[20]在乙醇/水溶液里加入AgNO3作为银源，加入聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂制备银纳米粒子。他们首先称量0.10g的PVP（K-30）放入20mL的乙醇中，使其混合均匀。再称取0.017g的AgNO3加入到10mL的乙醇中，搅拌使其完全溶解，再逐滴缓慢滴入到上述混合均匀的PVP-乙醇混合溶液中，接着将混合液转入总体积为40mL的内衬为聚四氟乙烯的高压釜中，置于恒定温度180℃下反应18h，在降低温度到室温后，放进高速离心机中进行离心分离。所得到的沉淀产物用去离子水和乙醇洗涤三次，在50℃下真空干燥即可得到想要的银纳米粒子。图7即为银纳米粒子的TEM图像。图7.溶剂热还原法制备得到的银纳米粒子的TEM图。基于壳聚糖还原的银纳米粒子的合成壳聚糖是一种从天然的甲壳素中提取的多糖聚合物，由于其存在活性氨基和羟基官能团，所以展现出独特的聚集阳离子、螯合和成膜性质，而且其本身就存在一定的抗菌活性。Wei等[26]利用无毒、可生物降解的壳聚糖还原AgNO3从而制备出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有高效抗菌活性的银纳米粒子。在一个基于壳聚糖的制备银纳米粒子的典型实验中，Wei等将4mL，52mM/L的AgNO3和10mL，6.92mg/mL的壳聚糖溶液混合，并且搅拌均匀。然后，将上述混合物转移到一个12.5×2cm的试管中，然后在95℃时放置12h。溶液的颜色从无色变为淡黄色，并且最终在反应开始后几小时内转变为棕黄色。由此获得的银试样即是基于壳聚糖还原的制备而出的银纳米粒子。下图即为银纳米粒子的TEM图像。图8.壳聚糖还原制备所得的银纳米粒子的TEM图。1.2课题的提出1.2.1研究的目的及意义由于银纳米粒子在抗菌，催化和表面增强拉曼散射方面的重要应用，它已经引起人们深入研究的兴趣[21][22]。银已经被用作抗菌剂几百年了，但最近一段时间人们发现滥用银离子可能会增加细菌病毒的耐药性[23][24]。人们普遍认识到，银纳米粒子可能附着在细胞壁上，从而干扰细胞壁的通透性和细胞呼吸。纳米粒子也可能穿透到细胞内部，通过与含磷和含硫的化合物如DNA和蛋白质相互作用而对细胞造成损害[25]。同时使用银离子作为抗菌药物，也会受到银离子在含有Cl-的生物和环境介质中的溶解度的限制，因为AgCl具有非常低的溶解度，并且会迅速的从溶液中沉淀出来。因此单独的银离子抗菌剂并不是一种特别良好的抗菌剂。壳聚糖，从天然的甲壳素中提取的一种多糖聚合物，由于活性氨基和羟基官能团的存在展现出独特的聚集阳离子，螯合和成膜性质。壳聚糖也展现出许多有趣的生物学活性，包括抗菌活性，诱导植物抗病性，以及对多种人类细胞的不同刺激或抑制活性[26][27]。由于它的阳离子特性会导致膜的破坏，膜的破坏会导致细菌死亡，因此壳聚糖是一种安全无毒，可生物降解的优秀的抗菌剂。在考虑到壳聚糖与银纳米粒子各自的优缺点之后，我们有必要将二者的优点结合起来，提出一种制备更加优秀的抗菌剂的方法，同时通过实验观察银纳米粒子的杀菌活性和细胞毒性。1.2.2研究内容和实验方法本实验中，我们用通过壳聚糖还原法制备银纳米粒子，然后通过实验测定银纳米粒子的表面形貌特征和它的粒度特征，选择出合适的银纳米粒子。然后在通过银纳米粒子的抑菌和对细胞毒性测试的两个实验，判断出单独银纳米粒子对于细菌和细胞的毒性。最后，将银纳米粒子和不同浓度的溶菌酶结合在一起，混入大肠杆菌后涂布在固体LB培养基上，观察MG-1655大肠杆菌的菌落，从而判断出银纳米粒子结合溶菌酶的杀菌效果。壳聚糖还原制备银纳米粒子合成表征及性质测试2.1引言银纳米粒子由于其独特的性质被广泛应用于催化、能源、抗菌等方面。尤其是银纳米粒子的抗菌活性在近些年来更是被越来越多的人所重视。合成银纳米粒子的方法有很多，其中包括物理法中的机械球磨法、激光烧蚀法和化学法中的电化学还原法、光化学还原法等。其中使用壳聚糖还原硝酸银（AgNO3）制备银纳米粒子的方法就是一种相当绿色环保的方法，同时由于壳聚糖本身就具有一定的抗菌杀菌活性，因此银纳米粒子的抗菌效果有望得到加强。在以往的研究中，Feng等[7]以壳聚糖作为保护剂和分散剂，通过液相还原法制备出了水溶性的银纳米粒子，然后通过化学键负载育脱脂棉表面，制备出了对于葡萄球菌和大肠杆菌具有良好抗菌效果的抗菌棉纤维。图9.负载银纳米粒子前（a）和后（b）的扫描电镜图。银纳米粒子具有强效抗菌效果，但是同样对于细胞也具有一定的毒性，因此银纳米粒子对于细胞毒性的测试也是不可避免的一项实验。溶菌酶是一种能够水解致病菌中黏多糖的碱性酶，对于细菌具有强效的杀菌效果，因此为了得到更加强力的杀灭作用，将银纳米粒子与溶菌酶结合起来就是一种理所当然的方法了[28]。同时，实验的结果将有利于抗菌灭菌领域更加深入的研究。2.2材料与试剂实验中所用的试剂如下表1所示，其中实验中所需的菌株为大肠杆菌（E.coliMG-1655）由苏州大学材料与化学化工学部生物大分子专业储存备用。表1.实验中所需试剂名称及其生产厂家仪器名称生产厂家硝酸银（AgN03）分析纯国药集团化学试剂有限公司壳聚糖（Chitosan）（脱乙酰度≥95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司氯化钠（分析纯）国药集团化学试剂有限公司蛋白胨（分析纯）英国OXOID公司酵母提取物（分析纯）英国OXOID公司琼脂粉（分析纯）北京索莱宝科技有限公司2.3实验仪器实验中相关的仪器如下表2所示表2.实验中所使仪器及其生产厂家仪器名称生产厂家Milli-QBiocel超纯水仪Millipore（美国）FA2104电子分析天平上海恒平科学仪器有限公司电热恒温水锅上海精宏实验设备有限公司UV-7504紫外分光光度计上海欣茂仪器有限公司VarioskanFlash多功能酶标仪美国ThermoScientific公司85-2型恒温磁力搅拌器巩义予华仪器有限责任公司空气恒温摇床上海新苗医疗器械制造有限公司高压灭菌器上海中安医疗器械厂DF-101S智能恒温加热磁力搅拌器上海东玺制冷仪器设备有限公司KQ-100E型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司101型电热鼓风干燥箱北京市永光明医疗仪器厂微量移液器美国Gilson公司H-600透射电子显微镜（TEM）日本日立公司ZetasizerNano-ZS90动态光散射仪英国Malvern公司2.4银纳米粒子的合成提前用王水浸泡250mL圆底烧瓶，冲洗干净，干燥。称取6.9mg、8.65mg、11.5mg、17.3mg、34.6mg壳聚糖，加入9.9mL的超纯水，0.1mL的乙酸混合均匀。提前搅拌过夜处理，增加溶解度。称取1.766gAgNO3粉末并加入20mL超纯水量取过夜处理的50mL溶液与AgNO3溶液混合在95℃下持续反应12h。即可得到所需的银纳米粒子。2.5适合银纳米粒子的选择实验吸取200μL样品用多功能酶标仪在200-800nm范围内测定紫外-可见吸收光谱。综合考虑，从而判断出适合接下来实验的银纳米粒子的浓度。2.6银纳米粒子粒度表征首先使用动态光散射仪（DLS）测量银纳米粒子的水合粒径。粒子表面形貌和实际粒径的观察采用透射电镜（TEM）。将样品滴在铜网上晾干，置于TEM下观察。测量银纳米粒子的表面形貌和实际粒径，进一步判断银纳米粒子是否适合接下来的实验。2.7银纳米粒子的抑菌实验抑菌实验主要选取了大肠杆菌（E.coli）(MG-1655)作为实验材料，采用LB培养基培养。首先制备LB培养基，液体LB培养基是由去离子水400mL，4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g氯化钠组成的；固态LB培养基是由去离子水400mL，4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g氯化钠，6g琼脂粉组成的。称量混合均匀后的培养基均在高压灭菌锅内124℃下灭菌40min，取出后振荡混匀备用。细菌的培养均采用少量的甘油菌与适量液体培养基混匀的方式，置于37℃振荡培养箱中在190rpm振荡培养14h。接着将银纳米粒子复合物分别稀释8、10、20、50、100倍（保持银纳米粒子的最终浓度为0,0.8,1.6,4,8，10μg/mL）。测量大肠杆菌的OD值，之后通过计算将其稀释到OD值为0.01（保证细菌的密度为107个/mL），每组试样中加入50μL的大肠杆菌的菌液，再加入25μL的不同浓度的银纳米粒子（需要加入25μL的PBS作为对照），再加入425μL的PBS，每组至少三个平行试样，在恒温培养箱里培养2h后取出，取50μL稀释100倍后涂布在固体LB培养板上，观察实验现象。2.8银纳米粒子对于细胞毒性的测试银纳米粒子对细胞的毒性主要通过CCK-8测试。将T25培养瓶内的L929细胞用1mL无菌PBS清洗一次，加入1mL胰蛋白酶并置于并放置于37℃恒温培养箱培育3min，当在显微镜下观察细胞呈亮球状时将胰蛋白酶吸出，并加入2mL1640培养基吹打瓶底至细胞完全脱壁悬浮为止。随后将细胞悬浮液转移至离心管内在1200rpm下离心5min，除去上清液，再次以3mL1640培养基进行重悬。充分混匀后,取20μL细胞悬液与20μL胎盼蓝溶液混匀，转移至血球计数板内并采用正置显微镜进行计数。据此算得细胞密度之后以6000/孔的密度将细胞种到96孔板内，并使得孔内最终体积为200μL(含20μL胎牛血清，180μL细胞悬液和1640培养基)，隔天换液时加入纳米粒子，使得最终浓度分别0，0.8,1.6,4,8,10μg/mL每种浓度设置三个平行样。在培养至3天时进行CCK-8测试，向每个孔中加入100μL1640塔养基，10uLCCK-8溶液.向时留3个做空白对照(无细胞，仅有CCK-8与1640溶液)，在37℃培养箱中放置1h，用枪吹打，尽量使细胞脱壁。取100μL于新的96孔板中，在450nm下测得其吸收值并作图。2.9不同浓度的银纳米粒子结合溶菌酶后的抑菌实验称量5mg溶菌酶，量取5mL的超纯水混合均匀得到1mg/mL的溶菌酶溶液。然后在每个小试管中加入1mL使用34.6mg壳聚糖还原制备所得到的银纳米粒子，再加入0、5、10、20、30μL的溶菌酶溶液，最后分别按顺序加入超纯水30、25、20、10、0μL的超纯水，振荡10h后取出，离心机离心，吸取上清液，继续加超纯水补水到1mL处。从每个样品中取500μL加水加到10mL（即稀释20倍）,标记好顺序。然后开始培养细菌，挑一点细菌到2mL液态LB溶液中，恒温振荡10h左右。取1mL菌液，放在离心机中离心，吸去上清液，加入PBS混合均匀，继续离心重复上述操作。取100μL混合后菌液，加入400μLPBS使其稀释5倍。取20μL稀释后样品测OD值，用PBS作为对照，测出稀释5倍对应的OD值，计算出稀释多少倍才能使其OD值等于0.01，用PBS稀释。取50μL稀释后样品，再取25μL不同的银纳米粒子（需要加入25μL的PBS作为对照），再加入425μL的PBS，每组两个平行样。放在恒温培养箱里培育2h。将样品稀释100倍后取50μL样品涂布在板上，倒放，恒温培育12h。观察板上细菌的个数，并作图。第三章结果与讨论3.1银纳米粒子的紫外-可见吸收性质为了选择出尺寸适合的银纳米粒子进行接下来的实验，使用了紫外-可见吸收光谱来判断出粒径大小合适，分布均匀的银纳米粒子样品。紫外-可见吸收光谱如图10所示。图10.五种样品的紫外-可见吸收光谱。上图的五条线A-E分别代表的是制备银纳米粒子时所加的壳聚糖的质量不同的样品，它们的质量分别是6.92、8.65、11.5、17.3、34.6mg。图中E样品（34.6mg）在400nm左右有个强吸收峰，这一般被认为是银纳米粒子的表面等离子吸收。表面等离子共振强烈依赖于金属粒子的形状，球形粒子表现为单一的谱峰。可以发现E的谱线对称且峰型较窄，表明此纳米粒子单分散性较好，粒径较均一，而A-D样品的谱线较平缓且对称性较差，表明A-D样品的银纳米粒子的单分散性不及E的单分散性，而且粒径也不均一。因此为了接下来的实验，选择E样品（壳聚糖含量为34.6mg的制备所得的银纳米粒子样品）。3.2银纳米粒子的形貌通过测量银纳米粒子的水合粒径和实际粒径来判断壳聚糖质量为34.6mg的样品是否适合进行银纳米粒子的抗菌试验。通过使用透射电子显微镜观察银纳米粒子的实际粒径。银纳米粒子的TEM图如下图11所示。图11.银纳米粒子的TEM图。上图观察可以得到银纳米粒子的表面形貌及其实际粒径。由图11可知，银纳米粒子呈球状且形状较为规则，并没有发生聚集现象，同时粒径大小分布比较均匀，大约为10nm左右，因此从TEM图观察来看，此样品适合接下来的实验。动态光散射仪可以测量样品的水合粒径，测量样品的图如下图12所示。图12.银纳米粒子的粒径分布。从上图可以看出，34.6mg壳聚糖制备所得的银纳米粒子的样品的水合粒径分布大致在3-13nm左右，且主要分布在5-8nm，样品的粒径大小均匀，适合进行接下来的抗菌试验。3.3银纳米粒子的抑菌性质银纳米粒子的抑菌实验是观察不同浓度的银纳米粒子对于大肠杆菌的灭杀效果。将加入不同浓度的银纳米粒子的大肠杆菌试样涂抹在固体LB培养基上，实验结果如下。图13.不同浓度的银纳米粒子的涂板效果图。图14.银纳米粒子的抑菌率。图中1#至6#样品的银纳米粒子的最终浓度为0,0.8,1.6,4,8，10μg/mL。1#样品是当银纳米粒子的浓度为0μg/mL时，即不存在银纳米粒子，抑菌率为零，不存在杀菌作用。2#样品的银纳米粒子的浓度是0.8μg/mL，可以看出与不存在银纳米粒子的1#样品相比，板上菌落显著减少，抑菌率更是达到80%左右，杀菌效果显著。随着银纳米粒子的浓度增大，板上的细菌菌落越少，即杀灭的细菌越多，抗菌效果越好。6#样品的银纳米粒子达到10μg/mL，板上菌落几乎全部消失，同时抑菌率也达到100%，杀菌作用强大。因此可以得出结论：银纳米粒子的杀菌效果和抑菌率随着银纳米粒子的浓度的增大而增加。3.4银纳米粒子的细胞毒性银纳米粒子的细胞毒性的测试主要通过Cell

Counting

Kit-8（简称CCK-8）试剂测试。其原理大致为该试剂会与细胞脱氢酶发生氧化反应生成具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye），而甲瓒物的数量和活细胞的数量成正比，因此数量越多则表示活细胞越多，细胞毒性差[29]。测量细胞毒性的实验测量450nm的吸收值，结果如下图所示。图15.CCK-8细胞毒性测试450nm的吸收值。图16.细胞存活率的变化图。由于CCK-8试剂会与活细胞发生反应产生黄色甲瓒产物，因此黄色甲瓒产物越多，即表示着活细胞数量越多。同时黄色甲瓒产物越多，吸收波长就越多，吸光度就越大。因此吸光度越大即表示活细胞数量越多，细胞毒性越差。上图15展示的是CCK-8实验在450nm的吸光度。当银纳米粒子浓度为零时，吸光度最大，活细胞数量最多。随着银纳米粒子浓度的增加，吸光度逐渐减小，细胞毒性增强。在银纳米粒子浓度达到8μg/mL时，溶液吸光度为零，表示细胞全部死亡。图16表示的是细胞存活率的变化图。从图中可以看出，随着银纳米粒子浓度的增加，曲线呈下降趋势，细胞存活率在浓度为8μg/mL时变为零。因此最终得出结论：银纳米粒子的细胞毒性随着浓度的增大而增加。3.5银纳米粒子结合溶菌酶的抑菌作用为了检测银纳米粒子和溶菌酶同时作用的抗菌效果，我们将银纳米粒子和溶菌酶结合起来，将样品与大肠杆菌混合，涂板后观察菌落数目，得出其对大肠杆菌的杀菌效果。结果显示如下图17所示。图17.不同浓度的银纳米粒子结合溶菌酶的涂板结果图。图中①号样品是不加银纳米粒子和溶菌酶的样品，②-⑤号样品是加入1mL银纳米粒子后分别加入0、5、10、20、30μL的溶菌酶的样品。结果显示，①号样品比②号样品菌落多，可以得出结论：银纳米粒子对于大肠杆菌具有杀菌效果。通过将样品②（溶菌酶的量为0μL）与样品③进行对比，可以得出：银纳米粒子与溶菌酶结合后的抗菌效果是比纯银纳米粒子要更强的。对于样品③-⑤，可以看出，随着溶菌酶浓度的增加，涂板上菌落的数目逐渐减小，银纳米粒子结合溶菌酶的抗菌效果逐渐增强。将涂板上的菌落数目计数清楚，使用公式杀菌率=（①号样品菌落数-x号样品菌落数）/①号样品菌落数，可以计算出不同溶菌酶浓度的样品的抑菌率，画出如下图18。图中②号样品对应横坐标为零，意味着只有银纳米粒子而无结合溶菌酶的样品，抑菌效率为57.84%。可以看出，随着结合溶菌酶量的增加，样品的抑菌效率越高，杀菌作用越强，在结合溶菌酶含量达到30μL时，几乎达到100%杀菌（99.65%）。图18.不同浓度的溶菌酶的抑菌率。

第四章结论与展望4.1结论在本次实验中，我们通过绿色环保的壳聚糖作为还原剂，AgNO3作为银源，制得银纳米粒子；同时通过扫描透射电镜和动态光散射仪观察和测量制备所得的银纳米粒子的表面形貌和粒径大小，通过此方法选择形貌大小适合的银纳米粒子继续接下来的实验。制备出适合实验的银纳米粒子之后，通过测量其对大肠杆菌（E.coliMG-1655）和L929细胞的杀灭效果，观察银纳米粒子的抑菌效应及其对细胞的毒性。最后，我们将银纳米粒子与溶菌酶结合起来，加入到大肠杆菌（E.coliMG-1655）中，观察最后生长出的菌落数目，得出银纳米粒子与溶菌酶的杀菌作用的规律。通过研究结论如下：（1）通过扫描透射电镜等仪器的观察，最后发现加入34.6mg壳聚糖制备所得的银纳米粒子表面形貌、尺寸大小正合适接下来的实验；（2）通过抑菌实验和对细胞毒性的实验得出结论，随着银纳米粒子的浓度增加，杀菌作用和对细胞的毒性变大；（3）在结合溶菌酶的实验中，我们发现，在银纳米粒子结合溶菌酶后，它的杀菌效果显著增强，同时随着溶菌酶含量的增加，它的杀菌效果不断增强。4.2展望随着纳米产业的蓬勃发展，银纳米粒子的杀菌作用越来越受到人们的关注。银纳米粒子具有杀菌作用，同时银纳米粒子结合溶菌酶的杀菌作用更强，因此在未来的生物、医药行业必然占据重要的位置。但是银纳米粒子对于细胞也具有一定的毒性，因此银纳米粒子的广泛应用仍需要未来的人们做出更深的研究，扬长避短地在抗菌领域应用银纳米粒子。参考文献1.KamatPV.Photophysical,photochemicalandphotocatalyticaspectsofmetalnanoparticles[J].JournalofPhysicalChemistryB,2002,106:7729-24.2.JonesCM,EHoeMV.Areviewoftheantibacterialeffectsofsilvernanomaterialsandpotentialimplicationsforhumanhealthandtheenvironment[J].JournalofNanoparticleResearch,2010,12:1531–1551.3.ShihC,ShiehY,TwuY.Preparationofgoldnanopowdersandnanoparticlesusingchitosansuspensions[J].CarbohydratePolymers,2009,78:309-15.4.余杭,丁夕然,白帆,李美成.形貌可控银纳米粒子制备及其在太阳能电池中的应用[J].中国科技论文,2012,7（2）:135-141。5.ShrivastavaS,SinghSK,MukhopadhyayA,etal.Negativeregulationoffibrinpolymerizationandclotformationbynanoparticlesofsilver[J].ColloidsandsurfacesB:Biointerfaces.2011,82;241-246.6.王旭珍.银纳米粒子的制备及其在光催化中的作用[J].功能材料,2009,40（9）:1573-1576。7.冯晓燕等.壳聚糖-银纳米粒子抗菌棉纤维灭菌机理初探[J].化工新型材料,2016,44（10）:204-206.8.DammC,MunstedtH.Kineticaspectsofthesilverionreleasefromantimicrobialpolyamide/silvernanocomposites[J].AppliedPhysicsA:MaterialsScience&Processing,2018,91:479–486.9.NealAL.Whatcanbeinferredfrombacterium-nanoparticleinteractionsaboutthepotentialconsequencesofenvironmentalexposuretonanoparticles?[J].Ecotoxicology,2008,17:362–371.10.Aubin-TamME,Hamad-SchifferliK.Structureandfunctionofnanoparticlesproteinconjugates[J].BiomedicalMaterials,2008,3(3):3400111.BayrakterH,YouCC,RotelloVM,etal.Facialcontrolofnanoparticlebindingtocytochromec[J].JournalofAmericaChemistrySociety,2007,129(10):2732-2733.12.HainfedJF,PowellRD.Newfrontiersingoldlabeling[J].JournalofHistochemistry&Cytochemistry,2000,48(4):471-480.13.DongCF,ZhangXL,CaiH,etal.Sodiumalginatemediatedrouteforthesynthesisofmonodispersesilvernanoparticlesusingglucoseasreducingagents[J].RareMetalMaterialsandEngineering,2016,45(2):261-266.14.ChenXY,ZhangP,CaiM,etal.Techniqueapproachofpreparinglow-temperaturesinteringofnanosilverpastewithreversemicroemulsionsystem[J].ElectronicComponents&Materials,2016,35(3):32-35.15.LuoQQ,LiKJ,PengLH,etal.Preparationandantimicrobialapplicationofsilvernanoparticlesmodifiedwithgallicacid[J].ChinaLeather,2016,45(5):5-9.16.DongCF,ZhangXL,CaiH,etal.Synthesisofmonodispersesilvernanoparticlesbywet-chemicalreductionmethod[J].FineChemicals,2013,30(10):1092-1095.17.PengC,ChenW,etal.Preparationsandcharacterizationofnano-silver[J].MaterialsChemist