有关葛根薄层鉴别与提取工艺的实验报告

实验一葛根药材的真实性鉴定1.1仪器生物显微镜[BA210、Motic]、镊子、载玻片、盖玻片、酒精灯、单〔双〕面刀片、紫外分析灯〔254nm和365nm〕[WFH-203B、上海精科实业]、硅胶HF254板、层析缸、天平[JH202、上海精密科学仪器]、锥形瓶、超声振荡仪[SB-5200D、宁波新芝生股份]、量筒、点样毛细管、水浴[XMTE-8112、上海精宏实验设备]。1.2试剂水合氯醛试液、蒸馏水、稀甘油、甲醇[分析纯AR批号:20120508国药集团化学试剂]、乙酸乙酯[分析纯AR批号:T20110822国药集团化学试剂]、氯仿[分析纯AR批号:20131227国药集团化学试剂]。1.3材料待鉴定天然药物及对应药材粉末各5份。5份未知药材分别为葛根〔豆科植物野葛Puerarialobata〔Willd.〕Ohwi的枯燥根〕、粉葛〔混乱品种：豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的枯燥根〕、劣质葛根、未知生药1〔伪品〕、未知生药2〔伪品〕；葛根制剂愈风宁心片；葛根素对照品、葛根对照药材、粉葛对照药材。2.实验方法2.1葛根及粉葛的性状鉴定观察并记录〔文字记录及数码采集图像〕药材性状特征，鉴定其是否符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下标准。葛根的性状鉴别：完整的块根呈圆柱形。外表褐色，具纵皱纹，可见皮孔及须根痕。质坚实。饮片呈纵切的长方形厚片或小方块，长5-35cm，厚0.5-1cm。外皮淡棕色，有纵皱纹，粗糙。切面黄白色，纹理不明显。质韧，纤维性强。气微，味微甜。粉葛的性状鉴定：呈圆柱形，类纺锤形或半圆柱形，长12-15cm，直径4-8cm；有的为纵切或横切的厚片，大小不一。外表黄白色或淡棕色，未去外皮的呈灰棕色。体重，质硬，富粉性，横切面可见由纤维形成的浅棕色同心性环纹，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹。气微，味微甜。2.2葛根、粉葛和愈风宁心片的显微鉴定水装片：取少许粉末，置于载玻片中央，滴适量蒸馏水，用针将粉末分散均匀，将盖玻片以45°夹角盖上，用大拇指按压盖玻片，无气泡最正确。用于观察淀粉粒。水合氯醛装片：取少许粉末，置于载玻片中央，用解剖针将粉末分散均匀，加1-2滴水合氯醛试液，在酒精灯上透化，重复2-3次透化后加半滴甘油。将盖玻片与载玻片以45°夹角盖上，用大拇指按压盖玻片，无气泡最正确。用于观察纤维、导管形态等。观察并记录〔文字记录及数码采集图像〕原料药粉末显微特征，鉴定其是否符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下标准，鉴定其制剂愈风宁心片是否符合该药品质量标准。葛根的显微特征：粉末淡棕色。淀粉粒单粒球形，直径3-37μm，脐点点状，裂缝状或星状；复粒由2-10分粒组成。纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。石细胞少见，类圆形或多角形，直径38-70μm。具缘纹孔导管较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。粉葛的显微特征：粉末黄白色。淀粉粒甚多，单粒少见，圆球形，直径8-15μm，脐点隐约可见；复粒多，由2-20分粒组成，纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。石细胞少见，类圆形或多角形，直径25-43μm。具缘纹孔导管较大，具缘纹孔圆形，排列极为紧密。2.3葛根、粉葛及其制剂的TLC鉴别葛根素对照品溶液、天然药物原料药及其制剂供试品溶液的制备：①对照品溶液制备：取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，制成对照药材溶液。②药材供试品溶液制备：天然药物原料药(5个样品)0.1g加甲醇10ml，超声处理20min，将上清液滤出，药液置蒸发皿中水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。③制剂供试品制备：取愈风宁心片2片，除去包衣，研细，加醋酸乙酯20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。点样：按照2015年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法〔附录ⅥB〕试验，吸取上述8种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，使成条状。展开：以三氯甲烷-甲醇-水〔7：2.5：0.25〕为展开剂，展开，取出，晾干。结果观察：置紫外光灯〔365nm和254nm〕下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应得位置上，显示相同颜色的荧光条斑。记录〔数码照相〕实验结果。 〔A组〕3.1性状鉴定观察可得，样品A应为葛根制剂愈风宁心片，青绿色包衣片，除去包衣后显棕褐色；味微苦、甜。样品B样品C样品D样品E样品F外皮颜色淡棕色黄白色淡灰棕色黄白色白色或淡黄色形状纵切的大小不一的小方块纵切或斜切的大小不一的小方块纵切的大小不一的小方块大小不一的不规那么片状及条状大小不一的小方块断面有纵皱纹，粗糙。切面黄白色，纹理不明显。横切面可见由纤维形成的浅棕色同心性环纹，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹。有纵皱纹，切面淡棕色，纹理明显，粗糙。切面黄白色，纹理不明显，有细小孔隙。表皮纹细、纹理不明显，断面白色细腻，颗粒性。气味气微，味微甜。气微，味微甜。气微，味微甜。气微、味微涩。气微，味微酸。其它质韧，纤维性强。体重，质硬，富粉性，纤维性强。质韧，纤维性强。体重，质硬，不易折断。体重，质坚实。3.2显微鉴定样品B样品C样品D样品E样品F颜色淡棕色黄白色淡褐色黄白色黄白色淀粉粒单粒球形，直径3-37μm，脐点点状、裂缝状或星状；复粒由2-10分粒组成。甚多，单粒少见，圆球形，直径8-15μm，脐点隐约可见；复粒多，由2-20分粒组成。单粒球形，直径3-37um，脐点点状、裂缝状或星状；复粒由2-10多分粒组成。单粒扁卵形、类圆形、三角状卵形或矩圆形，脐点点状、人字状、十字状或短缝状，可见层纹；复粒稀少，由2-3分粒组成。无晶纤维纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞大多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。纤维多成束，壁厚，木化，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚。无可见颗粒状团块，菌丝细长，稍弯曲，有分枝，无色或带棕色，横壁偶可察见石细胞少见，类圆形或多角形，直径38-70μm少见，类圆形或多角形，直径25-43μm少见，类圆形或多角形，直径38-70μm少见，类圆形或多角形少见，类圆形或多角形具缘纹孔导管较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。较大，具缘纹孔圆形，排列极为紧密。较大，具缘纹孔六角形或椭圆形，排列极为紧密。除具缘纹孔导管外还有网纹、螺纹及环纹导管。无样品B：淀粉粒晶纤维石细胞具缘纹孔导管样品C：淀粉粒晶纤维石细胞具缘纹孔导管样品D：淀粉粒晶纤维石细胞具缘纹孔导管样品E：淀粉粒石细胞具缘纹孔导管样品F：石细胞晶纤维3.3TLC鉴别123456789123456789〔254nm紫外灯下TLC图〕〔365nm紫外灯下TLC图〕1：葛根素对照品；2：野葛对照品；3：粉葛对照品；4：样品A--愈风宁心片；5-9：样品B-F各组分比移值〔Rf〕：Rf1=0.30；Rf2=0.27、Rf2’=0.70；Rf3=0.25；Rf4=0.27、Rf4’=0.68；Rf5=0.27、Rf5’=0.67；Rf6=0.25；Rf7=0.30、Rf7’样品8、9无明显荧光现象。3.4实验结果通过性状鉴别、显微鉴别、TLC鉴别及Rf值的比照，得出结论：样品A为愈风宁心片；样品B为葛根；样品C为粉葛；样品D为劣质葛根；样品E为伪品1〔推测可能为天麻〕；样品F为伪品2〔推测可能为茯苓〕。考前须知：①TLC鉴别点样时点样量不宜过大，易造成拖尾；注意边缘效应，点样时边缘预留出一定距离。②制片时粉末不宜过大，且需分散均匀，便于观察。性状鉴别：观察可得，样品A应为愈风宁心。片样品C外表黄白色，纵切面可见由纤维形成的数条纵纹，粉性强，推测为粉葛。样品B、D外表淡棕色，推测可能葛根。E、F无此特征，推测可能为伪品。观察其性状，F虽性状类同粉葛，无粉性，有可能为茯苓。显微鉴别：样品B、D可观察到单粒球形淀粉粒；含草酸钙方晶的晶纤维且含晶细胞壁木化增厚；少见石细胞，类圆形或多角形；较大的具缘纹孔导管，具缘纹孔六角形或椭圆形，推测可能为葛根。样品C观察到淀粉粒甚多，单粒少见，复粒多；纤维成束，周围细胞多含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁木化增厚，推测可能为粉葛。样品E无法观测到晶纤维，样品F无法观测到淀粉粒与具缘纹孔导管，推测其可能为伪品。TLC鉴别：与对照品在254nm下相比拟，粉末样品A、B、C、D对照品在相应位置上均有颜色相同的斑点。根据斑点与对照品的比拟以及在同样点样量下斑点颜色深浅比拟，推论出A是愈风宁心片，B是葛根，C是粉葛，D是劣质葛根。E、F未显示斑点，为伪品。总结：性状鉴定与显微鉴定可以推测样品B、D为葛根，C为粉葛，E、F为伪品，。TLC鉴定可知样品是否含葛根素以及含量上下，由此区分优葛(B)、劣葛(D)、粉葛〔C〕和伪品1、2。综上所述，得出结论：样品A为愈风宁心片；样品B为葛根；样品C为粉葛；样品D为劣质葛根；样品E为伪品1〔推测为天麻〕；样品F为伪品2〔推测为茯苓〕。实验二葛根总黄酮的提取工艺研究仪器与材料旋转蒸发仪【RE-52AA上海亚荣生化仪器厂】、鼓风枯燥箱、水浴锅、煎煮锅、玻璃层析柱、纱布、量筒、容量瓶、蒸发皿、移液管、洗耳球、电子天平【JA5002上海精天电子仪器】、乙醇、甲醇、蒸馏水豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的枯燥根【批号140206上海康桥中药饮片】、AB-8大孔吸附树脂取葛根〔野葛〕饮片80g，置煎煮锅中，加10倍量水〔800ml〕，温室浸泡半小时。大火煮沸然后小火保持微沸状态1小时，纱布过滤提取液，药渣用8倍量水〔640ml〕再煮沸半小时，纱布过滤提取液。合并两次提取的滤液，混合均匀，测量总体积并记录。精密量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容〔测试样品1〕，以备测定水提物总黄酮的含量；奇遇水煎液常压浓缩至1g生药/ml〔80ml〕，另精密量取5.0ml〔相当于5g生药量〕的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干称重，计算水煎法浸膏得率。其余水煎浓缩液〔75ml〕加2倍量95%乙醇〔150ml〕，搅拌，4℃放置约1小时，沉淀。减压抽滤，测量滤液体积，量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以30%乙醇定容〔测试样品2〕，以备测定水提醇沉纯化后样品总黄酮的含量；减压回收剩余滤液，浓缩至2.5g生药/ml〔30ml〕。另精密量取2.0ml相当于5g生药量的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干，称重，计算水提醇沉纯化法所得浸膏得率。剩余样品，14ml供药效试验〔药理样品A〕、14ml供大孔树脂实验。取90ml已经预处理好的大孔树脂AB-8吸附剂，装柱，上样14ml〔相当于35g生药〕葛根提取液，吸附平衡半小时。先以去离子水洗脱出去水溶性杂质，至检测无多糖反响为止。再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液，至无黄酮络合反响，测量70%乙醇洗脱液的总体积。量取0.50ml置于10.0ml容量瓶中，以备测定大孔树脂纯化后黄酮含量〔测试样品3〕。剩余洗脱液减压浓缩至上样体积〔14ml，相当于2.5g生药/ml〕，精密量取2.0ml〔相当于5g生药量〕的药液于已经记录重量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘干称重，计算大孔树脂纯化法浸膏得率。表1样品中黄酮含量测试总体积(ml)样品体积(ml)稀释倍数吸光度A样品浓度(μg/ml)总黄酮含量(mg)测试样品1715500测试样品22021250测试样品31061000表2不同提取纯化工艺结果的比拟提取方法浸膏得率(%)总黄酮含量(%)总黄酮提取率(%)水提水提醇沉大孔树脂纯化44.讨论与小结天然药物中化学成分的组成一般比拟复杂，往往有效成分和其他杂质共存，各成分含量差异也比拟大。别离纯化技术有利于提高产品有效成分的含量，确保天然药物的质量、疗效和稳定性。常用的提取方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取