核酸的结构与功能分子生物学

关于核酸的结构与功能分子生物学第3章核酸的结构与功能

3.1

细胞内的遗传物质

3.2

核酸的化学组成与共价结构

3.3DNA的二级结构（双螺旋模型）

3.4DNA分子的高级结构

3.5

真核生物的染色体及其组装

3.6RNA的结构与功能

3.7

核酸的变性、复性与分子杂交第2页,共80页，2024年2月25日，星期天3.1细胞内的遗传物质3.1.1DNA是主要的遗传物质

1869年，瑞士的内科医生FriedrichMiescher从外科医院包扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，并指出它是由一种碱性蛋白质与一种酸性物质组成的，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleicacid)。第3页,共80页，2024年2月25日，星期天1885—1900年间，Kossel、Johnew、Levene证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷酸。1929年又确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。第4页,共80页，2024年2月25日，星期天1928年英国科学家Griffith进行了著名的肺炎双球菌转化实验。但转化源（transformingprinciple）的化学本质仍是一个谜。分离出活的S型细菌第5页,共80页，2024年2月25日，星期天16年之后首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery（1944）。第6页,共80页，2024年2月25日，星期天9年之后1952年D.Hershery和M.Chase

再次用T2噬菌体标记实验证实了DNA是遗传物质的本质。第7页,共80页，2024年2月25日，星期天20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构，最终确立DNA是遗传信息的载体。作为遗传物质的DNA具有以下特性:

①

储存并表达遗传信息；②

能把遗传信息传递给子代；③

物理和化学性质稳定；④

有遗传变异的能力。第8页,共80页，2024年2月25日，星期天3.1.2RNA也是遗传物质

1956年美国的两位科学家A.Gierer和G.Schraman发现烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,TMV），其遗传物质是RNA。

1957年美国的HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre用重建实验证实了这一结论。第9页,共80页，2024年2月25日，星期天第10页,共80页，2024年2月25日，星期天

一些病毒采用RNA作为遗传物质。

类病毒只由RNA组成。类病毒，无壳病毒：一种病毒样感染颗粒，含单链、共价闭环RNA，无蛋白质外壳。类病毒结构上与一些内含子近似，可能代表逃逸的内含子。第11页,共80页，2024年2月25日，星期天3.2核酸的化学组成与共价结构

3.2.1核酸的化学组成

核酸（nucleicacid，多核苷酸）

↓

核苷酸（nucleotide，单核苷酸）┌─────┴─────┐

↓

↓

磷酸（phosphate）

核苷（nucleoside）

┌─────┴─────┐

↓

↓

戊糖（amylsugar

）含氮碱基（base）第12页,共80页，2024年2月25日，星期天1.碱基(base)第13页,共80页，2024年2月25日，星期天2.核苷（nucleosides）

戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷。第14页,共80页，2024年2月25日，星期天1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子与戊糖Ｃ－1所连的羟基形成糖苷键。第15页,共80页，2024年2月25日，星期天3.核苷酸（nucleotideacid）脱氧核糖碱基磷酸AGCT第16页,共80页，2024年2月25日，星期天3.2.2核酸的共价结构1.DNA的一级结构与功能

DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序，简称为DNA顺序（或序列）。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。第17页,共80页，2024年2月25日，星期天DNA一级结构的表示法5´3´结构式5´3´

p

p

p

pOH3´ACTG1´线条式5′ACTGCATAGCTCGA3′字母式第18页,共80页，2024年2月25日，星期天2.RNA的一级结构与功能

RNA分子中核苷酸的排列顺序叫做RNA的一级结构。OHOHOH5´3´

RNA与DNA的差异

DNARNA糖脱氧核糖核糖碱基AGCTAGCU不含稀有碱基含稀有碱基第19页,共80页，2024年2月25日，星期天3.3DNA的二级结构(双螺旋模型)Watson&Crick建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：1、DNA的X射线衍射分析结果；2、蛋白质的α螺旋模型；3、氢键理论；4、1950[英]Chargaff

规则（当量定律）。第20页,共80页，2024年2月25日，星期天3.3.1双螺旋模型（doublehelixmodel）特征

(1)

DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。

(2)两条链反向平行，即两条链的方向相反。5´3´5´3´磷酸核糖碱基第21页,共80页，2024年2月25日，星期天(3)糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。

(4)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。

(5)

碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。

(6)DNA双螺旋有大沟（majororwidegroove）和小沟（minorornarrowgroove）的存在。T-A碱基对C-G碱基对第22页,共80页，2024年2月25日，星期天

（1）碱基对之间的氢键

（2）碱基堆集力它包括：①疏水作用②范德华力

（3）磷酸基的负电荷斥力3.3.2维持DNA双螺旋的作用力第23页,共80页，2024年2月25日，星期天3.3.3DNA二级结构的其他形式(双螺旋结构的多态性)

在双螺旋的总体特征之下，能产生各种二级结构的变化，这称为DNA二级结构的多样性或多态性(polymorphism)。

DNA结构产生多态性的原因在于核苷酸链的骨架含许多可转动的单键，从而使糖环可采取不同的折叠形式和苷键采取不同构象。

DNA的构象现已知有A，B，C，D，E，T，Z7种。第24页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）B-DNA的构象

Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型。相对湿度92%的DNA钠盐。是大多数DNA在细胞中的构象。右手双螺旋。第25页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）A-DNA的结构右手螺旋。相对湿度为75%的DNA钠盐。螺旋体短粗，大沟变得窄而深，小沟变得宽而浅。结晶的A型-DNA纤维在吸收了水分后能够变长，并转变为B型-DNA。

A-DNA比较常见在RNA分子的双股发夹螺旋区域、RNA-DNA杂交双链中。第26页,共80页，2024年2月25日，星期天（3）Z-DNA的结构1972年

Pohl

etal发现poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；1979年

WangA.H-J(王惠君),A.Rich对d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出Z－DNA模型。第27页,共80页，2024年2月25日，星期天

嘌呤和嘧啶交替排列，高盐。左手螺旋。细长，只有一条窄而深的小沟，大沟消失。

天然DNA的局部可出现Z-DNA。

CpG二核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化形成5-甲基胞嘧啶，可导致B-DNA向Z-DNA转化。第28页,共80页，2024年2月25日，星期天

Z-DNA构象有转录起始的调节活性。Z-DNA构象在转录区上游离转录区近时，抑制转录；若离转录区远时，可以增加转录区的负超螺旋程度而促进转录。第29页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4DNA分子的高级结构（其他DNA螺旋结构）3.4.1单链核酸形成的二级结构单链核酸也可由于部分序列之间的碱基配对而形成分子内或分子间的双螺旋区域。反向重复序列间间隔较短或无间隔反向重复序列间间隔较长第30页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4.2短片段的重复序列短片段的重复顺序可分为三种类型：（1）正向重复(directrepeats)又叫顺向重复；（2）反向重复(invertedrepeats)

；（3）回文顺序

(Palindromicsequence)5′-GTGAGCTCAC-3′3′-CACTCGAGTG-5′

第31页,共80页，2024年2月25日，星期天上海自来水来自海上农学人才多多才人学农画上荷花和尚画书临汉字翰林书顺反相同第32页,共80页，2024年2月25日，星期天

能在DNA或RNA中形成发夹结构。通常是作为一种特别信号。如：限制性内切酶的识别位点；一些调控蛋白的识别位点。限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点第33页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4.3三股螺旋的DNA

1957年，Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链。如：polyA/polyU；polydA/polydT；

polyd(AG)/polyd(CT)。

1987年，Mirkin.S.M证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在。第34页,共80页，2024年2月25日，星期天DNA分子内的三链结构

多聚嘌呤多聚嘧啶DNA分子间的三链结构三股螺旋DNA的生物学意义：◆参与基因表达调控。◆RNA分子参与表观遗传调节。◆基因治疗或定向诱变。第35页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4.4DNA的四链结构

2002年，一组英国科学家发现染色体端粒DNA可以形成四链结构，并测定了其晶体结构。GGGG5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTT第36页,共80页，2024年2月25日，星期天功能

（1）稳定真核生物染色体结构

（2）保证DNA末端准确复制

（3）与DNA分子的组装有关

（4）与染色体的meiosis&mitosis有关

第37页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4.5DNA的结构的动态性与精细结构1.DNA结构的动态性：不同DNA结构形式相互转变的现象。在活细胞中，下面几种因素能使DNA双螺旋构象发生相互转变：（1）核苷酸顺序（碱基组成）；（2）盐的种类和浓度；（3）相对湿度。

第38页,共80页，2024年2月25日，星期天

DNA双螺旋结构的呼吸作用:

DNA双链中氢键的迅速断裂和再生过程。在DNA双螺旋结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡之中，局部开链的泡状结构对于DNA结合蛋白识别DNA内部所含信息以及与DNA结合都有重要作用。第39页,共80页，2024年2月25日，星期天2.DNA分子的精细结构(局部构象)DNA双螺旋的许多结构参数不是完全均匀的，是随着碱基序列的不同而在一定范围内变化的，称为DNA双螺旋的局部构象。在DNA双螺旋中，依赖于序列的构象变化的主要形式有：（1）螺旋扭转角：两个相邻碱基对之间绕螺旋轴旋转的夹角在28°-42°变动。（2）螺旋桨效应。第40页,共80页，2024年2月25日，星期天3.4.6DNA的超螺旋结构与拓扑学性质1.DNA的超螺旋结构（DNA的三级结构）

螺旋超螺旋第41页,共80页，2024年2月25日，星期天

超螺旋（superhelix）是双螺旋DNA进一步扭曲盘绕形成的三级结构。超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，双螺旋DNA的松开导致负超螺旋(negativesuperhelix)，而拧紧则导致正超螺旋(positivesuperhelix)。天然的DNA都呈负超螺旋，但体外可得到正超螺旋。第42页,共80页，2024年2月25日，星期天超螺旋可能有两方面的生物学意义：（1）超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，得以包装在细胞内；（2）超螺旋能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其他分子，如酶、蛋白质分子的相互作用。第43页,共80页，2024年2月25日，星期天2.DNA超螺旋结构的拓扑学性质

拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。（1）连环数（linkingnumber,L）：连环数指双螺旋DNA中两条链互相缠绕交叉的总次数，L为整数。一个闭合环状DNA分子，只要其主链的共价键不断裂，连环数值就不会改变。（2）盘绕数（twistingnumber,T）：盘绕数是DNA分子中双螺旋的周数，表示DNA分子一条链绕另一条链的扭转数。对于松弛态的环状DNA，以每周10.5个碱基对计算，T=碱基对总数/10.5。即DNA分子中Watson-Crick螺旋数，是双螺旋自身的性质。第44页,共80页，2024年2月25日，星期天（3）超螺旋周数（writhingnumber,W）：超螺旋周数指双螺旋结构在一定的盘绕数（T）下，DNA分子的超螺旋缠绕数，即整个DNA分子在双螺旋基础上，一条双螺旋链绕另一双螺旋链缠绕转动的周数，它表示DNA超螺旋的程度，负超螺旋的W为负值，正超螺旋的W为正值。

White方程：L=T+W（T与W的值可以是小数，但L的值必须是整数）（4）连环数比差（λ）

λ=ΔL/L0=(L-L0)/L0超螺旋密度第45页,共80页，2024年2月25日，星期天第46页,共80页，2024年2月25日，星期天第47页,共80页，2024年2月25日，星期天3.5真核生物的染色体及其组装3.5.1真核生物的染色体

19世纪中叶，发现染色体。染色体只包含1个DNA分子，在细胞不同周期表现为不同形态，间期表现为染色质。其蛋白质与DNA的质量比约为2：1。常染色质染色质组成型异染色质异染色质兼性异染色质洛阳红

首案红第48页,共80页，2024年2月25日，星期天3.5.2染色体中的组蛋白

组蛋白(histones)是一种碱性蛋白质，等电点一般在pH10.0以上，其特点是富含二种碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，根据这两种氨基酸在蛋白质分子中的相对比例，将组蛋白分为五种类型：H1、H2A、H2B、H3、H4。特点：◆富含赖氨酸和精氨酸；◆进化上的极端保守性；◆无组织特异性；◆氨基酸分布的不对称性。第49页,共80页，2024年2月25日，星期天3.5.3核小体的形成

KlugA（英，获得1982年诺贝尔奖）。核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。每个核小体只有一个H1。

若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm计，200bpDNA的伸展长度为68nm，形成核小体后仅为11nm，长度压缩了6～7倍。①染色体DNA的一级包装——核小体第50页,共80页，2024年2月25日，星期天第51页,共80页，2024年2月25日，星期天

非组蛋白是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，所以又称序列特异性DNA结合蛋白，非组蛋白的特性是：①

含有较多的天门冬氨酸、谷氨酸，带负电荷，属酸性蛋白质；②

整个细胞周期都进行合成，而组蛋白只在S期合成，并与DNA复制同步进行；③

有明显的组织特异性。非组蛋白的功能是：①

帮助DNA分子折叠；②

协助启动DNA复制；③

有调节基因表达的作用。第52页,共80页，2024年2月25日，星期天3.5.4染色质的高级结构二级包装——染色质螺线管(chromatinsolenoid)

在H1组蛋白分子间的相互作用下，核小体链进一步盘绕形成一种中空螺线管，其外径为30nm，每圈含6个核小体。又压缩了6倍。第53页,共80页，2024年2月25日，星期天3三级包装——染色质纤维环(loopsofchromatinfiber)

螺线管纤维相隔一定间距的某些区段被“拉拢”固定在蛋白轴上，从而产生了许多从骨架上伸出的纤维环(loops)。DNA又压缩约100倍。第54页,共80页，2024年2月25日，星期天真核生物染色体DNA组装不同层次的结构侧环模型第55页,共80页，2024年2月25日，星期天3.6RNA的结构与功能

RNA通常是单链线型分子（一级结构），在分子内可自身回折形成局部的双螺旋（二级结构），进而折叠（三级结构）。除tRNA外，几乎全部细胞中的RNA都与蛋白质形成核蛋白复合物。第56页,共80页，2024年2月25日，星期天3.6.1RNA的结构特点及与DNA的区别（1）碱基组成不同。（2）RNA分子中有许多稀有碱基或微量碱基、修饰碱基。（3）核糖不同。

（4）对整个RNA分子而言，没有双螺旋结构。

（5）RNA分子中的碱基不遵守Chargaff法则。

（6）RNA在碱性溶液中十分敏感。

（7）增色效应没有DNA明显。

（8）DNA是遗传信息的储存者和携带者。而RNA是遗传信息的传递者和表达者。

（9）RNA分子携带和储存遗传信息。（10）某些RNA的特殊结构具有催化功能，称这些RNA为核酶。第57页,共80页，2024年2月25日，星期天3.6.2细胞中RNA的分布细胞质中的RNA（占总RNA的90%）可分为4大类：

①

转运RNA(transferRNA,tRNA)；

②信使RNA(messengerRNA,mRNA)；

③

核蛋白体RNA(ribosomeRNA,rRNA)。

④细胞质中的小分子RNA叫scRNA。scRNA与细胞内蛋白质转运有关。比如转运-信使RNA(transfer-messengerRNA,tmRNA)。tmRNA兼具tRNA分子和mRNA分子的双重功能。细胞核内的RNA（占总RNA的10%）统称为nRNA，由两部分组成：

①一部分是核内mRNA、tRNA和rRNA的初始转录混合物；

②

另一小部分是核内小分子RNA(smallnuclearRNA,snRNA)。功能是参与hnRNA的加工。第58页,共80页，2024年2月25日，星期天3.6.3RNA分类概述1.mRNA的结构（占细胞总RNA的3%-5%

）m7G5’ppp5’Nm(Nm)5’帽子(A)nAAOH3’polyAAAUAAAUGAUAAUAGAUG5’非编码区3’非编码区编码区翻译起始调节区定位信号

真核细胞mRNA的基本结构第59页,共80页，2024年2月25日，星期天酵母tRNAAla

的二级结构DHU环IGC反密码子反密码环氨基酸臂可变环TψC环CCAAla3´5´二级结构特征：单链三叶草叶形四臂四环2.tRNA的结构（约占细胞总RNA的15%）第60页,共80页，2024年2月25日，星期天tRNA的三级结构：

tRNA的三级结构是倒L形。在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型。所有tRNA有以下共同特点:（1）含稀有碱基和稀有核苷较多,达核苷酸总量的5%～20%。（2）不同的tRNA尽管核苷酸组分和排列顺序各异，但其3′端都含有CCA序列，是所有tRNA接受氨基酰化的特定位置。CCA序列由tRNA合成后酶促加工产生，而非tRNA基因编码。（3）所有的tRNA分子都折叠成紧密的三叶草二级结构和L形立体构象，结构较稳定，半衰期均在24h以上。第61页,共80页，2024年2月25日，星期天5sRNA的二级结构3.rRNA的结构（占细胞总RNA的80%）

基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。特征：

单链，螺旋化程度较tRNA低

与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能。核糖体由RNA和蛋白质组成，真核细胞中两者比例为1：1，原核细胞为2：1。第62页,共80页，2024年2月25日，星期天4.snRNA(smallnuclearRNA,snRNA)细胞核小分子RNA

核内小RNA，snRNA是含70～300个核苷酸的小分子RNA，占细胞RNA总量的0.1%-1%。主要参与基因初始转录产物加工。5.snoRNA

核仁小分子RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA)广泛分布于从酵母到哺乳动物细胞的核仁区，大小一般在几十到几百个核苷酸，主要功能是参与rRNA前体的加工。6.非编码的mRNA（ncRNA）非编码mRNA与传统的mRNA一样可进行剪接和3’端加尾修饰，但不具有典型的可读框（ORF）；它们参与许多生理过程，是一些调控RNA。第63页,共80页，2024年2月25日，星期天DNA的变性过程加热部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对3.7核酸的变性、复性与分子杂交3.7.1核酸的变性（denaturation）或解链（melting）

指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件：1）加热。2）极端的pH。3）有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。第64页,共80页，2024年2月25日，星期天DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为增色效应。第65页,共80页，2024年2月25日，星期天DNA的变性温度：

通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为DNA的变性温度（融解温度，Tm）。

Tm（meltingtemperature）是使DNA双螺旋链解开一半时的温度。DNATm一般在70—85℃之间。第66页,共80页，2024年2月25日，星期天影响DNATm值的因素:(1)DNA的均一性,均一性高,熔解过程会发生在一个很窄的范围内。(2)G+C的含量,含量越高,Tm值越高。经验公式为:(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44（马默多蒂（Marmur-Doty）关系式）Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41（G+C)%，＜25bp的寡核苷酸的Tm计算：Tm＝4（G+C）+2（A+T）。(3)

溶液中的离子强度:一般来说,离子强度低,熔解温度低,熔解温度范围宽。第67页,共80页，2024年2月25日，星期天G-C含量越高，Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.41℃。第68页,共80页，2024年2月25日，星期天第69页,共80页，2024年2月25日，星期天3.7.2核酸的复性与分子杂交1.核酸的复性(renaturation)及复性条件

指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程(又称退火,annealing)

。DNA的复性有两个必要条件：

（1）一定的离子强度，用于削弱两条链中磷酸基团之间的排斥力，通常使用0.15～0.50mol/LNaCl；

（2）较高的温度，用以避免随机形成的无规则氢键，但也不能太高，否则不能形成有效的氢键以维持稳定的双链。第70页,共80页，2024年2月25日，星期天2.DNA的复性动力学曲线

成核作用（nucleation）、拉拉链作用（Zippering）复性过程基本上符合二级反应动力学。双链DNA的复性过程方程是：dsDNA2ssDNA

根据二级反应动力学公式：

dC/dt=-K2C