兽医公共卫生学第二十章 实验室生物安全与管理

第二十章实验室生物安全与管理2021/11/231

从20世纪40年代起，微生物学和生物医学实验室的感染问题已经引起了多国政府的重视，70年代兴起并迅速发展的以重组DNA技术为代表的现

代生物技术，引发了生命伦理、生态环境等社会、经济安全问题。

2003~2004年，新加坡、台湾和北京发生的实验室SARS冠状病毒泄露而造成的实验室人员感染事件，使实验室生物安全问题变成了现实危害，引起了全世界的高度关注，也促使我国对实验室生物安全管理立法，《病原微生物实验室生物安全管理条例》（2004年颁布，2016年、2018年分别进行了修订）。2021/11/232一、实验室生物安全二、生物安全实验室建立与防护2021/11/234实验室生物安全2021/11/235一、生物安全的概念与范围（一）生物安全的概念

生物安全：指对病原微生物、转基因生物及其产品、外来有害微生物等

生物体对人类、动植物、微生物和生态环境可能产生的潜在风险或现实危害的防范和控制。

广义的生物安全（Biosecurity）:

指为了防止给国家、社会造成重大损失，针对偷窃生物因子和恶意使用生物因子而采取的综合措施。

狭义的生物安全（biosafety）:指避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。

主要指实验室生物安全，包括病原微生物的实验室生物安全和重组DNA分子的实验室生物安全两个方面。（二）生物安全的范围（1）防范生物恐怖。（2）防止外来生物入侵。（3）保障转基因生物体安全。（4）病原微生物的控制，高等级生物安全实验室的建立及管理。（5）生物治疗、干细胞、克隆技术等引发的生命伦理问题。2021/11/238二、实验室生物安全的概念和术语（一）实验室生物安全的概念

实验室生物安全：指用以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的防护原则、技术以及实践。2021/11/239（二）实验室生物安全的有关术语（1）生物因子（bio-agents）：指一切微生物和生物活性物质。（2）生物威胁（bio-threat）：指生物因子形成的使人忧虑的、可能发生的严重危害。（3）生物危险（bio-risk）：由生物因子形成的潜在的危害，是伤害发生的概率及其严重性的综合。2021/11/2310（4）生物危害（bio-hazard）：由生物因子形成的伤害。狭义的生物危害是指病原微生物和具有潜在危险的重组DNA分子直接或间接地给人、动物或/和植物带来的不良影响和损伤。

对人类及动物有危害的生物或生物性物质

：包括但不限于动物

、植物

、微生物

、病毒及含有病原体的组织切片、体液

、固体废弃物和

呼出气等。（5）危险废弃物（hazardouswaste）：

有潜在危险的废物，即可燃、易燃、腐蚀、有毒、传染、放射或有其他破坏作用的废物。2021/11/2311（6）气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为0.001～100

μm的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。

气体介质称连续相，通常是空气；微粒或粒子（particles）称分散相，成分很复杂。（7）生物气溶胶（bio-aerosol）：在分散体系中微粒或粒子称分散相，分散相内含有微生物的气溶胶称为生物气溶胶。2021/11/2312（8）高效空气过滤器（highefficiencyparticulateairfilter，HEPA）：指通常以0.3μm微粒为测试物，在规定的条件下滤除效率高于99.97%的空气过滤器。（9）生物安全防护（bir-safety

containment）：指避免生物危险因子，特别是偶然的和有意利用的生物因子，对生物体包括实验室工作者在内的人员的伤害和对环境的污染的意识和措施。

实验室生物安全防护分为一级防护（屏障）（primary

barriers）和二级防护（屏障）（secondary

barriers）。2021/11/2313（10）一级防护（屏障）（prinary barriers）

：指实验室的生物安全柜和

个人防护装备等构成的防护屏障。用以减少或消除危害性生物因子的暴露。（11）二级防护（屏障）（secondary barriers

）：指实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。除了能保护实验室人员，还能保护周围人或动物免受生物因子意外扩散所造成的感染。2021/11/2314（12）生物安全柜（bio-safetycabinet，BSC）：负压过滤排风柜。防止操作者和环境暴露于实验过程中产生的生物气溶胶。生物安全柜是生物安全实验室必备的装备。2021/11/2315（13）安全罩（safetyhood）：置于实验室工作台或仪器设备上的负压排风罩，以减少实验室工作者的暴露危险。2021/11/2316（14）实验室分区（laboratoryarea）：

根据生物因子污染概率的大小，实验室可进行合理的分区。①

清洁区：指在正常情况下不可能有实验因子污染的区域。人员通道、前室、控制室、机房、洗涤室等，此区可不做特殊个人防护。②半污染区：指在正常情况下只有轻微污染可能的区域。如第一缓冲间和准备间属于此区。此区的功能是大量的准备工作，例如培养基、细胞、制剂的配制、低温冰箱的放置等。③

污染区：指操作实验因子的地方（BSL-3中心实验室），在操作过程中一定会有污染的区域，一般情况下空气有轻微污染，操作必须小心谨慎。在此区工作的人必须做好全部个人防护。2021/11/2317（15）气锁（airlock）：气压可调节的气密室，用于联结气压不同的两个相邻区域，其两个门具有互锁功能，不能同时处于开启状态。在实验室中用作二区的过渡通道。（16）缓冲间（bufferroom）：

设在生物安全实验室的清洁区与半污染区之间，或半污染区与污染区之间的类似于气锁的密闭小室，小室的两门互锁，且不能同时处于开启状态。2021/11/231821/11/23 1920（17）定向气流（directionalairflow）：在气压低于外环境大气压的实验室中，从污染概率小且相对压力高处向污染概率高且相对压力低处流动的气流。（18）个人防护装备（personalprotectiveequipment，PPE）：用于防止人员受到化学和生物等有害因子伤害的器材和装备。如防护服，面罩，护目镜等。2021/11/2320（19）硬件和软件

硬件：指实验室的设备和个人防护装备和设施。

软件：实验室的生物安全管理体系，如组织机构、管理制度、操作规程、人员素质等。2021/11/2321（20）生物安全实验室（biosafety

laboratory）

指通过规范的实验室设计建造、实验设备的配置、个人防护装备的使用，严格遵从标准化的工作操作程序和管理规程等，确保操作生物危险因子的工作人员不受实验对象的伤害，确保周围环境不受其污染，确保实验因子保持原有本性的实验室。

包括：生物实验室和动物实验室。2021/11/2322三、实验室感染的类型和来源（一）实验室感染的类型

第一种是气溶胶导致的实验室感染，

第二种是事故性感染，

第三种是人为破坏。232021/11/23（二）实验室感染的来源（1）标本来源：包括检测标本和菌毒种；检测标本又包括实验室研究标本和临床检验标本。（2）仪器设备使用过程产生的污染

：如离心机使用不当可产生气溶胶、飞溅物等。（3）操作过程产生的污染：如用吸管吹吸微生物悬液可产生微生物气溶胶。（4）实验动物：饲养的动物将接种的病原体通过呼吸、粪、尿等途径排出体外，污染环境，实验室人员防护或操作不当，接触到污染物而被感染。2021/11/2324四、病原微生物实验室的主要生物危险2021/11/2325

病原微生物实验室许多操作过程中可以产生微生物气溶胶，并随空气

扩散而污染实验室的空气，当工作人员吸入了污染的空气，便可以引起实验室相关感染。

病原微生物实验室的主要生物危险是吸入感染性气溶胶而引起的空气传播感染。（一）病原微生物实验室产生微生物气溶胶的类型（1）液滴核气溶胶（dropletnucleiaerosol）（又称为飞沫核气溶胶）：是由于外力作用在含有微生物的液体（如液本标本，培养液等）形成的颗粒进入空气。

较大的颗粒很快沉积在各种物体表面形成了含有微生物的尘埃。

较小的颗粒水份很快蒸发形成液滴核（粒径<5μm）。它们分散漂浮在空气中，漂浮时间长，传播面积广，分散距离长。2021/11/2326（2）粉尘气溶胶（dust

aerosol）

由于外力作用于干燥的培养物或尘埃粒子，悬浮于空气中形成粉尘气溶胶。

经过现代技术加工微生物干粉可能导致生成含水量很低、粒子大小适中，分散度强，易被吸收的干粉气溶胶，而造成人体感染。2021/11/2327（二）影响实验室气溶胶危害性的因素☞包括：微生物的致病力，气溶胶浓度，气溶胶粒径，工作人员防护设备和实验室内环境条件等。（1）气溶胶粒径➢粒径在50～100

μm的液滴，能很快沉降在各种物体表面上，如果沉降在伤口或黏膜表面上，感染的可能性最大；➢粒径在

10～50μm的飞沫，可在空气中扩散，但不易吸入呼吸道，最终也沉降在各种物体表面上；2021/11/2328➢1～5

μm粒子可直接进入肺泡；➢6～10

μm易沉着于小支气管；➢10～30

μm会沉积在支气管内。（2）一般来讲，微生物气溶胶颗粒越多，粒径越小，实验室的环境越适合微生物生存，引起实验室感染的可能性就越大。2021/11/2329（三）实验室感染的主要原因☞对276种实验室操作进行测试，其中有239种操作可以产生微生物气溶胶，占全部实验室操作的86.6%。☞将上述各种实验操作归纳为21大项，根据其操作中产生微生物气溶胶的数量可分为重度、中等、轻度三个等级。2021/11/2330轻度（<10个颗粒）中度（11～100个颗粒）重度（>100个颗粒）玻片凝集试验倾倒病毒液火焰上灼热接种环颅内接种接种鸡胚或抽取培养液腹腔接种动物，局部不涂消毒剂试验动物尸体解剖用乳钵研磨动物组织离心沉淀前后注入、倾到、混悬病毒液病毒液滴落在不同表面上用注射器从安瓿中抽取毒液接种环接种平皿、试管或三角烧瓶等打开培养容器的螺旋瓶盖摔碎带有培养物的平皿离心时离心管破裂打碎干燥菌种安瓿打开干燥菌种安瓿搅拌后立即打开搅拌器盖小白鼠鼻内接种注射器针尖脱落喷出病毒液刷衣服、拍打衣服2021/11/2331表1 可产生各种严重程度微生物气溶胶的实验室操作☞一次可产生大量微生物气溶胶的操作危害程度固然较大，而那些一次操作产生微生物气溶胶量较少，却需要多次重复的操作，也可以在短暂的时间内产生大量的微生物气溶胶，对工作人员的危害也较大。☞微生物气溶胶在一个实验室内产生后，还可以通过气流转移到同一建筑物的其他地方，甚至污染整个建筑物的空气。☞布鲁菌属、Q热立克次体、鹦鹉热衣原体和结核分支菌等病原体的大部分实验室感染暴发都是由感染性气溶胶引起。2021/11/2332生物安全实验室建立与防护2021/11/2333一、实验室生物安全防护的基本原理（一）实验室生物安全防护的构成☞

构成实验室生物安全防护的因素包括硬件和软件两方面。2021/11/232021/11/2335（二）生物安全实验室的组成☞一般由主实验室（核心工作间）、其他实验室和辅助用房组成。（三）实验室生物安全防护水平分级☞我国与国际通行的实验室生物安全防护水平分级标准一致，分别为BSL-1（实验室一级生物安全防护水平）、BSL-2（实验室二级生物安全防护水平）、BSL-3（实验室三级生物安全防护水平）、BSL-4（实验室四级生物安全防护水平）。☞实验室生物安全防护水平（biosafetylevel，BSL）分为四级，一级防护水平最低，四级防护水平最高。2021/11/23361.

一级生物安全防护水平（BSL-1）☞实验室操作、安全设备和设施适用于从事已熟悉其生物学特征的、通常对健康成人不致疾病的生物因子（对应于我国的第四类危害的微生物）研究的生物安全防护水平。2021/11/2337☞BSL-1适用于进行基础的教学和研究。☞BSL-1不需要特殊的一级和二级屏障，主要是依靠标准的微生物操作来获得基本的防护水平（不是简单的依赖于洗手池等清洗设施）。2021/11/23382.二级生物安全防护水平

（BSL-2）☞实验室操作、安全设备和设施适用于操作对实验室人员和动物致病性低，对环境有轻微危害（对应于我国的第三类危害的微生物）的病原微生物工作的生物安全防护水平。☞BSL-2适用于对人血液、体液和组织等是否存在未知感染性生物因子的标本进行的操作。2021/11/2339☞BSL-2条件下的主要危险是意外地经皮肤或黏膜接触或摄入感染性物质。☞对于污染的针头或利器应采取及其严格的防范措施，采用良好的微生物学技术，便可在开放实验台上进行BSL-2

的操作。☞但是当可能生成气溶胶时，需增加BSC、高压灭菌器、安全离心机罩帽、防溅罩或面罩等进行防护。2021/11/23403.三级生物安全防护水平

（BSL-3）☞实验室操作、安全设备和设施适用于操作具有潜在的呼吸道传染性、可引起严重或致死性疾病的病原微生物（对应于我国的第二类危害的微生物）工作的生物安全防护水平。☞BSL-3条件下的主要危险是自身接种（自伤或经破损皮肤））、经口摄入和暴露于感染性气溶胶。☞BSL-3实验室有严格的一级防护屏障和二级防护屏障的要求，以防止实验室操作人员、相邻区域的工作人员、社区和环境暴露于可能的感染性气溶胶。如应用BSC，特殊通风系统等。2021/11/234111/232021/424.四级生物安全防护水平

（BSL-4）☞实验室操作、安全设备和设施适用于操作对个体具有高度危害性、并可通过空气途径进行传播或传播途径不明的、无有效预防和治疗措施的病原微生物（对应于我国的第一类危害的微生物）工作的生物安全防护水平。2021/11/2343☞BSL-4条件下的主要危险是呼吸道暴露于感染性气溶胶、黏膜暴露于感染性飞沫和自身接种。☞BSL-4实验室一般是独立建筑物或处于完全隔离的区域，并有复杂的特殊通风系统和废弃物处理系统。☞通过Ⅲ级生物安全柜或Ⅱ级生物安全柜加正压防护服把实验室操作人员与传染性气溶胶完全隔离开。2021/11/23442021/11/2345二、实验室生物安全标志2021/11/2346☞在BSL-2～BSL-4实验室的门上，应标有国际通用的生物危险警告标志，在生物危险符号的下方应同时标明实验室名称、操作的病原体名称、生物危害等级、预防措施负责人姓名、紧急联络方式等有关信息。☞国际通用的生物危险警告标志的颜色为黑色，背景为黄色，见图1。实验室名称预防措施负责人病原体名称紧急联络方式生物危害等级图1 国际通用的生物危害警告标志授权人员方可进入2021/11/2347三、生物安全实验室的个人防护2021/11/2348（一）个体防护装备的概念☞个体防护装备（personalprotection

equipment，PPE）是指为了保护实验室工作人员免受化学、生物与物理等有害因子伤害的器材和用品。☞所采用个体防护装备，主要是用于保护实验人员免于暴露在生物危害物质，如气溶胶、喷溅物以及意外接种、感染动物的手术及解剖等危险的一种物理屏障。2021/11/2349502021/11/23二、防护的部位☞个人防护装备所要防护的部位主要包是眼睛、头面部、躯体、手、足、耳（听力）以及呼吸道。三、个人防护装备☞装备防护包括眼镜（安全眼镜、护目镜）、口罩、面罩、防毒面具、帽子、防护衣（实验服、隔离衣、连体衣、围裙）、手套、鞋套以及听力保护器等。2021/11/2351四、不同生物安全等级实验室的个人防护要求（一）BSL-1实验室（1）进入实验室时应穿工作服，工作服不能穿到实验区外；（2）实验操作中应戴上手套，必要时应配戴防护眼镜。2021/11/2352（二）BSL-2实验室➢

在BSL-1上增加：（1）工作服外加穿罩衫或穿防护服，

戴帽子、口罩

；（2）在BSC外操作微生物时，必须使用面部保护装置（如护目镜、面罩等）。2021/11/2353（三）BSL-3实验室➢在BSL-2上增加：（1）进入实验室时必须使用个体防护装备，包括两层防护服（如后开口服、全身覆盖服、两件套服、连衣裤）、两层手套、生物安全专业防护口罩（不能使用医用外科口罩等）；（2）在有传染性动物的动物室内应戴模压面罩或防毒面具；（3）动物实验时需加戴防撕咬手套；（4）穿专用靴子等防护性鞋罩。2021/11/23542021/11/2355（四）BSL-4实验室➢在BSL-3上增加：（1）工作人员必须接受最高水平的生物安全知识培训；（2）工作人员必须进行医学监测；（3）进入实验室时要更换全套服装，包括内衣裤的全部日常服装，并换上专用防护服；（4）室内有传染性灵长类动物时，必须使用面部保护装置；（5）进行容易产生高危险气溶胶的操作时，都要同时使用BSC或其他物理防护设备和个人防护器具（例如口罩和面罩）。2021/11/23562021/11/23572021/11/2358五、实验室生物安全操作技术规范2021/11/2359（一）实验室中样品的操作规范1.

样品容器（1）样品容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品；（2）样品容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏；（3）在容器外部不能有残留物；（4）容器上应当正确地粘贴标签以便于识别；（5）样品的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。（二）样品接收☞

需要接收大量样品的实验室应当安排专门的房间或空间。（三）

样品包装的打开☞

接收和打开样品的人员应当了解样品对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。☞样品的内层容器要在BSC内打开，并准备好消毒剂。2021/11/2360六、实验室防护设备和仪器的使用规范2021/11/2361（一）生物安全柜的使用规范（1）向使用者介绍BSC的使用方法和局限性，给工作人员发放书面的规章、安全手册或操作手册；BSC运行正常时才能使用；（2）BSC在使用中不能打开玻璃观察挡板；（3）BSC内应尽量少放置器材或标本，不能影响后部压力排风系统的气流循环；（4）BSC内不能使用本生灯或酒精灯，否则燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环；（5）所有工作必须在工作台面的中后部进行，能够通过玻璃观察挡板看到；（6）尽量减少操作者身后的人员活动；（7）操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流；2021/11/2362（8）不要使实验记录本﹑移液管以及其他物品阻挡空气格栅，这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露；（9）工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对BSC的表面进行擦拭；（10）在BSC内的工作开始前和结束后，BSC的风机应至少运行5

min；（11）在BSC内操作时，不能进行文字工作。2021/11/23632021/11/2364（二）离心机的使用规范2021/11/2365（1）使用实验室离心机时，仪器良好的机械性能是保障微生物安全的前提条件；（2）应按照操作手册来操作离心机；（3）离心机放置的高度应当使小个子工作人员也能够看到离心机内部，以正确放置十字轴和离心桶；（4）离心管和盛放离心标本的容器应当由厚壁玻璃制成，或最好为塑料制

品，并且在使用前应检查是否破损；（5）用于离心的试管和样品容器应当始终牢固盖紧（最好使用螺旋盖）；（6）离心桶的装载、平衡、密封和打开必须在BSC内进行；（7）操作指南中应给出液面距离心管管口需要留出的空间大小；（8）对于危险度Ⅲ级和Ⅳ级的微生物，必须使用可封口的离心桶（安全杯）；（9）当使用固定角离心转子时，必须小心不能将离心管装得过满，否则会导致漏液；2021/11/2366（10）应当每天检查离心机内转子部位的腔壁是否被污染或弄脏。如污染明显，应重新评估离心操作规范；（11）应当每天检查离心转子和离心桶是否有腐蚀或细微裂痕；（12）每次使用后，要清除离心桶、转子和离心机腔的污染；（13）当使用离心机时，可能喷射出可在空气中传播的感染性颗粒。2021/11/2367➢如果将离心机放置在传统的前开式的Ⅰ级或Ⅱ级BSC内，这些粒子由于运动过快而不能被BSC内的气流截留。➢良好的离心操作技术和牢固加盖的离心管可以提供足够的保护，以防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生。2021/11/2368（三）移液管和移液辅助器的使用规范（1