和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的抑制作用研究

和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的抑制作用研究【摘要】目的：具核梭杆菌作为牙周病的常见病原菌之一，引起了口腔感染性疾病的发生和传播。为了治疗该类疾病，抗生素的滥用使得病菌产生耐药性的问题频发，对人类健康造成危害。因此本课题探究了和厚朴酚对改善和解决具核梭杆菌通过生物被膜发挥作用产生耐药性问题的作用。方法：以具核梭杆菌作为受试菌株，以和厚朴酚作为受试药，以氯己定作为阳性药对照。首先采用微孔板法构建具核梭杆菌生物被膜体外模型；并通过CCK-8法、结晶紫半定量黏附实验测定生物被膜生长动力曲线和基质总量生长曲线；场发射扫描电子显微镜（SEM）观察生物被膜的微观形态结构，这三种方法验证生物被膜模型构建成功与否。其次，采用微量稀释法测定和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的最低抑膜浓度（MBIC）；采用CCK-8和结晶紫半定量黏附实验测定和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜代谢活性及基质总量的影响；通过SEM观察药物干预后受试菌株生物被膜的微观结构及形态变化。结果：根据三种验证方法得知具核梭杆菌受试菌株的生物被膜初始黏附期为0-36h，聚集期为36-48h，成熟期为48-96h。和厚朴酚对具核梭杆菌的最佳药物干预浓度为60μg/mL，中药单体和厚朴酚可在一定程度上降低具核梭杆菌不同阶段形成的生物被膜的代谢活性（P<0.05）以及减少生物被膜基质总量（P<0.05），破坏生物被膜形态结构，导致菌体死亡。结论：和厚朴酚对具核梭杆菌黏附期、聚集期和成熟期生物被膜的形成有一定的抑制作用，进而有望抵抗耐药性的产生。因此，为开发中药单体和厚朴酚成为一种新型的生物被膜抑制剂奠定了理论基础。【关键词】和厚朴酚；具核梭杆菌；生物被膜StudyonInhibitoryeffectofhonokiolonthebiofilmofFusobacteriumnucleatum[Abstract]Objective:Asoneofthecommonpathogensofperiodontaldisease,Fusobacteriumnucleatumcausestheoccurrenceandspreadoforalinfectiousdiseases.Inordertotreatthistypeofdisease,theabuseofantibioticscausesfrequentproblemsofbacterialresistance,posingathreattohumanhealth.Therefore,thepurposeofthisstudyistoexplorenewdrugstoimproveandsolvetheproblemofdrugresistancecausedbyFusobacteriumnucleatumactingthroughbiofilms.Method:UsingFusobacteriumnucleatumastheteststrain,honokiolasthetestdrug,andchlorhexidineasthepositivedrugcontrol.Firstly,aninvitromodelofFusobacteriumnucleatumbiofilmwasconstructedusingthemicroplatemethod;AndthegrowthkineticscurveofbiofilmandtotalmatrixgrowthcurveweremeasuredthroughCCK-8methodandcrystalvioletsemiquantitativeadhesionexperiment;Threemethodsofobservingthemicrostructureofbiofilmusingfieldemissionscanningelectronmicroscopy(SEM)areusedtoverifythesuccessofbiofilmmodelconstruction.Secondly,theminimuminhibitoryconcentration(MBIC)ofmagnololonthebiofilmofFusobacteriumnucleatumwasdeterminedusingmicrodilutionmethod;TheeffectsofmagnololonthemetabolicactivityandtotalsubstrateofFusobacteriumnucleatumbiofilmweremeasuredusingCCK-8andcrystalvioletsemiquantitativeadhesionexperiments;ObservethemicrostructureandmorphologicalchangesofthebiofilmofthetestedstrainafterdruginterventionthroughSEM.Result:Accordingtothethreevalidationmethods,theinitialadhesionperiodofthebiofilmofthetestedstrainsofFusobacteriumnucleatumwas0-36hours,theaggregationperiodwas36-48hours,andthematurityperiodwas48-96hours.TheoptimaldruginterventionconcentrationforFusobacteriumnucleatumwithmagnololis60μg/mL,traditionalChinesemedicinemonomerandmagnololcantosomeextentreducethemetabolicactivityofbiofilmsformedbyFusobacteriumnucleatumatdifferentstages(P<0.05)andreducethetotalamountofbiofilmmatrix(P<0.05),destroythemorphologyandstructureofbiofilms,andleadtobacterialdeath.Conclusion:Honokiolhasacertaininhibitoryeffectontheformationofbiofilmsduringtheadhesion,aggregation,andmaturationstagesofFusobacteriumnucleatum,whichisexpectedtoresistthedevelopmentofdrugresistance.Thus,theresearchprovidesatheoryfoundationfordevelopingtraditionalChinesemedicinemonomerandmagnololasanovelbiofilmsinhibitor.[Keywords]honokiolFusobacteriumnucleatumbiofilm目录TOC\o"1-3"\h\u170331前言 具核梭杆菌生物被膜体外模型的构建实验材料实验菌种具核梭杆菌标准株（ATCC25586），购于北京保藏生物科技中心。实验仪器表2-1实验仪器名称生产厂家SW-CJ-1F超净工作台苏净集团安泰公司24孔板无锡耐思生物科技有限公司DHP-9032B电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司氧气指示剂日本三菱瓦斯化学株式会社JSM-7610FPlus场发射扫描电子显微镜日本电子株式会社14mm无菌爬片北京白鲨生物科技有限公司iMark酶标仪美国BIO-RAD公司厌氧密封培养袋日本三菱瓦斯化学株式会社DSX-24L自控型手提式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂厌氧产气袋日本三菱瓦斯化学株式会社一次性无菌平皿广东环凯生物科技有限公司平底96孔板无锡耐思生物科技有限公司试剂与药物表2-2试剂与药物名称批号生产厂家0.1%结晶紫C916088上海麦克林生化科技有限公司脑心浸液肉汤20220208青岛高科技工业园海博生物技术有限公司CCK-8试剂盒MA0218-2-Oct-28G大连美仑生物技术有限公司2.5%戊二醛固定液（电镜专用）20220708北京索莱宝科技有限公司PBS缓冲溶液（7.2~7.5）GP2211005830武汉塞维尔生物科技有限公司：无水乙醇20211221广东光华科技股份有限公司叔丁醇20200612天津市大贸化学试剂厂甲醇20220601307天津市致远化学试剂有限公司实验方法培养基的配制脑心浸液琼脂培养基（BHI）：按照使用说明配备，准确称取培养基颗粒5.2g置于烧杯中，加入去离子水100mL；脑心浸液液体培养基（BHI）：按照使用说明配备，准确称取培养基颗粒7.7g置于烧杯中，加入去离子200mL；将以上培养基充分搅匀并溶解后，pH值调节至7.4±0.2，封口后于121℃高压灭菌30min。恒温至50℃左右时加入氯化血红素（5.0μg/mL）和维生素K1（10.0μg/mL）（琼脂培养基需加入5%无菌脱纤维羊血后倾注于平板中），混匀后于4℃冰箱保存备用。实验菌悬液的制备用接种环取活化后的受试菌少许，加入无菌生理盐水中稀释调整至与0.5号麦氏比浊管的浊度一致，即达到1.0×108CFU/mL浓度。取上述菌悬液200μL，加入BHI液体培养基稀释，得到浓度为1.0×106CFU/mL的实验菌悬液，现用现配。微孔板法构建具核梭杆菌生物被膜体外模型取2.2.2制备的具核梭杆菌菌悬液每孔200μL接种到96孔板中，在37℃恒温静置下分别厌氧培养至0、12、24、36、48、72、96、120h。CCK-8法测定生物被膜的生长动力曲线采用CCK-8实验测定受试菌株的生物被膜生长动力曲线。将2.2.3制备的生物被膜相应的时间段取出，使用无菌移液枪吸取并去掉各孔培养基和浮游菌、取生理盐水冲洗3遍，自然晾干后，加入100μL肉汤，避光加入10μL的CCK-8溶液/孔，全部加完后振荡混匀，37℃避光孵育1h，用酶标仪测量OD450处的吸光度值，记录结果并绘制菌株的生物被膜生长动力曲线。结晶紫半定量粘附实验测定生物被膜总量生长曲线采用结晶紫半定量黏附实验测定受试菌株的生物被膜基质总量生长曲线。取2.2.3中构建的生物被膜，在相应时间段，使用无菌移液枪吸取并去掉各孔培养基和浮游菌，取生理盐水轻洗1-3遍后，每孔加200μL甲醇固定生物被膜30min，吸弃甲醇，加入100μL0.1%结晶紫染液，染色15min后吸弃并使用生理盐水轻洗未粘附染料1-2遍。最后，加入95%乙醇溶解与生物被膜结合的染料，充分溶解后用酶标仪测量OD570的吸光度值，记录结果，绘制菌株生物被膜基质的生长曲线。场发射扫描电子显微镜（SEM）观察生物被膜微观形态结构在无菌24孔板上，用镊子将14mm的圆形爬片放入孔中，每孔加入1mL2.2.2制备的试验菌悬液，在37℃下分别恒温静置厌氧培养至12、36、48、72h，使用无菌移液枪吸弃各孔的培养基和浮游菌，用生理盐水轻洗1-3遍后，加入1mL2.5%戊二醛固定液（电镜专用）于4℃下固定一晚。吸弃固定液后，分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%浓度梯度乙醇对各孔进行洗脱，各梯度浓度每孔共洗脱2次，每次15min。最后用100%乙醇脱水2次，每次30min。弃去各孔中所有溶液，加入100%叔丁醇置换乙醇两次，每次30min。将脱水完成的各样品进行冷冻真空干燥后，将待测样品用导电胶粘在载物台上，采用真空离子溅射仪对各样品进行喷金处理90s后，置于扫描电子显微镜中并拍摄图片。实验结果及讨论具核梭杆菌受试菌株生物被膜生长动力曲线图2-1具核梭杆菌生物被膜生长动力曲线图由图2-1可知，受试菌株在0-36h段快速繁殖，对应生物被膜的黏附期；在36-48h时细菌不断聚集成菌落，对应生物被膜的聚集期；在48-96h细菌活细胞量基本保持不变，对应生物被膜的成熟期，此时菌落继续扩大并形成致密的成熟生物被膜。96h后，细菌活细胞量下降，进入生物被膜成熟末期，此时膜内细菌的代谢活性降低并开始从膜内脱落并扩散，进入下一轮循环。具核梭杆菌受试菌株生物被膜总量生长曲线图2-2具核梭杆菌生物被膜基质总量生长曲线图由图2-2可知，0-36h生物被膜基质总量增长得最快，对应生物被膜的黏附期；36-48h时细菌不断聚集成菌落并分泌大量的胞外聚合物，对应生物被膜的聚集期；48-96h细菌生物被膜总量增幅减缓，为生物被膜的成熟期。96h后生物被膜总量开始下降，即生物被膜开始脱落扩散，并进入下一个生物被膜形成的周期。场发射扫描电子显微镜（SEM）观察具核梭杆菌生物被膜的形态结构注：A：12h；B：36h；C：48h；D：72h；观察倍数：×10000图2-3具核梭杆菌不同时间段的生物被膜模型微观形态图由图2-3可知，在受试菌株培养到12h时，仅有单个细菌黏附在爬片表面。培养至36h时，细菌开始互相聚集，形成少量细菌团块。培养至48h时，细菌相互聚集黏附紧密，叠成团块，大量胞外聚合物产生，初步具有生物被膜的框架。培养至72h时，细胞团块有形成片状的生物被膜聚集体，且被包裹在生物被膜内，形成了具有一定厚度且致密的成熟的生物被膜。小结本章通过CCK-8实验绘制了具核梭杆菌生物被膜的生长动力曲线，通过结晶紫半定量黏附实验绘制了生物被膜基质总量的生长曲线，通过场发射扫描电子显微镜观察具核梭杆菌生物被膜的微观结构。综合上述生物被膜生长动力曲线以及生物被膜基质总量生长曲线的结果，确定具核梭杆菌受试菌株的生物被膜初始黏附期为0-36h，生物被膜聚集期36-48h，生物被膜成熟期为48-96h。从扫描电子显微镜观察的结果得，培养到12h时，单个细菌黏附在爬片表面。培养到36h时，细菌相互聚集形成少量细菌团块。培养到48h时，细菌初步形成生物被膜的框架。培养到72h时，细胞团块形成了有一定厚度且致密的成熟生物被膜。进一步验证了不同生长阶段生物被膜的生长状况。综上所述，后续实验选取第24h，42h，60h分别作为具核梭杆菌生物被膜的黏附期，聚集期及成熟期进行药物干预，探究中药单体和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜形成的作用影响。和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的作用实验材料实验菌种具核梭杆菌标准株（ATCC25586），购于北京保藏生物科技中心。实验仪器表3-1实验仪器名称生产厂家SW-CJ-1F超净工作台苏净集团安泰公司24孔板无锡耐思生物科技有限公司DHP-9032B电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司氧气指示剂日本三菱瓦斯化学株式会社JSM-7610FPlus场发射扫描电子显微镜日本电子株式会社14mm无菌爬片北京白鲨生物科技有限公司iMark酶标仪美国BIO-RAD公司厌氧密封培养袋日本三菱瓦斯化学株式会社DSX-24L自控型手提式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂厌氧产气袋日本三菱瓦斯化学株式会社一次性无菌平皿广东环凯生物科技有限公司平底96孔板无锡耐思生物科技有限公司试剂与药物表3-2试剂与药物名称批号生产厂家和厚朴酚（≥98%）C10026295上海麦克林生化科技有限公司氯己定（98%）C12196688上海麦克林生化科技有限公司0.1%结晶紫C916088上海麦克林生化科技有限公司脑心浸液肉汤20220208青岛高科技工业园海博生物技术有限公司CCK-8试剂盒MA0218-2-Oct-28G大连美仑生物技术有限公司2.5%戊二醛固定液（电镜专用）20220708北京索莱宝科技有限公司PBS缓冲溶液（7.2~7.5）GP2211005830武汉塞维尔生物科技有限公司：无水乙醇20211221广东光华科技股份有限公司叔丁醇20200612天津市大贸化学试剂厂甲醇20220601307天津市致远化学试剂有限公司实验方法培养基的配制同2.2.1操作。实验菌悬液的制备同2.2.2操作。药物贮备液的配备用DMSO溶解和厚朴酚并制成浓度为64mg/mL的和厚朴酚贮备液；氯己定配制成浓度为16mg/mL的阳性对照药物贮备液，用封口膜密封贮备液管口，避光保存于4℃冰箱内，备用。测定和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的最低抑膜浓度（MBIC）用BHI液体培养基将3.2.3制备的药物储备液分别稀释为5120μg/mL的和厚朴酚、2560μg/mL的氯己定药液。将3.2.2制得的Fn菌悬液取每孔200μL接种于96孔板中，37℃下恒温静置厌氧培养48~72h。用无菌PBS冲洗3遍去除各孔培养基和浮游菌。将上述稀释的药液分别各取200μL加入到96孔板中，设置第11列为生长对照孔，第12列为空白对照孔，于37℃恒温培养箱继续厌氧培养24h，观察结果。评估结果标准：以肉眼未见孔内浑浊的最低药物浓度为最低抑膜浓度（MBIC）。根据MBIC测定结果，确定最佳给药浓度。采用CCK-8法、结晶紫法和扫描电子显微镜共同评价药物对受试菌株生物被膜的清除作用。CCK-8法测定和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的细菌代谢活性影响取3.2.2制得的菌悬液200μL接种于96孔板上，在37℃下分别恒温厌氧培养至24h、42h、60h。在相应的时间段内，使用无菌移液枪吸弃各孔培养基和浮游菌，取生理盐水轻洗1-3遍，加入60μg/mL浓度和厚朴酚200μL，继续培养24h后，吸弃各孔溶液并使用生理盐水轻洗1-3遍，待自然晾干后，加入100μL肉汤，避光加入10μL的CCK-8溶液/孔，避光37℃下孵育1h后，用酶标仪测量OD450的吸光度值，重复3次并记录实验结果。同时用5.63μg/mL氯己定CHX设置阳性对照组，重复上述操作并给药，重复3次并记录实验结果。结晶紫半定量粘附法测定和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜总量的影响取3.2.2制得的菌悬液200μL接种到96孔板上，在37℃下分别恒温培养24h、42h、60h。在相应的时间段内，使用无菌移液枪吸弃各孔培养基和浮游菌，并用生理盐水轻洗1-3遍。加入60μg/mL浓度和厚朴酚200μL后继续培养24h，吸弃培养基和浮游菌，生理盐水轻洗1-3遍后，每孔加入200μL甲醇固定生物被膜。30min后，吸弃甲醇，每孔加入100μL结晶紫染液，染色15min后洗去未粘附的染料。使用生理盐水轻洗1-2遍后，每孔加入200μL的95%乙醇溶解与生物被膜结合的染料，并轻轻振荡使之充分溶解，用酶标仪测量OD570的吸光度值，重复3次并记录实验结果。同时用5.63μg/mL氯己定CHX设置阳性对照组，重复上述操作并给药，重复3次并记录实验结果。SEM观察和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜微观形态的影响取无菌24孔板，用镊子将14mm的圆形爬片放入各孔中，每孔加入1mL的菌悬液，在37℃下分别恒温厌氧静置培养至24、42、60h。使用无菌移液枪吸弃各孔的培养基和浮游菌，用生理盐水轻洗1-3遍，分别加入60μg/mL和厚朴酚和5.63μg/mLCHX各200μL，同时设置生长对照组继续培养24h，弃取培养基和浮游菌，生理盐水轻洗后，加入1mL2.5%戊二醛固定液（电镜专用）于4℃下固定过夜。吸弃固定液，分别使用30%、50%、70%、80%、90%、95%浓度梯度乙醇对各孔进行洗脱，各梯度浓度每孔共洗脱2次，每次15min。最后用100%乙醇脱水2次，每次30min。弃去各孔中所有溶液，加入100%叔丁醇置换乙醇两次，每次30min。将脱水完成的各样品进行冷冻真空干燥后，将待测样品用导电胶粘在载物台上，采用真空离子溅射仪对各样品进行喷金处理90s后，置于扫描电子显微镜中并拍摄图片。统计学分析使用软件ORIGIN对数据进行统计学分析，使用单因素方差分析，遵循t检验，得出P<0.05差异具有统计学意义。实验结果与讨论和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的最低抑膜浓度（MBIC）表3-3药物对具核梭杆菌用药的最低抑膜浓度（MBIC）药物最低抑膜浓度（MBIC）（μg/mL）和厚朴酚60.00±23.09氯己定5.63±3.15由表3-3可知，和厚朴酚对具核梭杆菌的最低抑膜浓度MBIC为60±23.09μg/mL，表明和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜具有一定的抑制作用；阳性药氯己定对Fn的MBIC为5.63±3.15μg/mL。和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜细菌代谢活性影响注：*表示和厚朴酚组与生长对照组比较，P＜0.05，**表示P＜0.001，***表示P＜0.0001；#表示和厚朴酚组与氯己定组比较，P<0.05。图3-1各药物组对具核梭杆菌三个生长阶段生物被膜代谢活性的影响图由图3-1可知，在受试菌株培养24h、42h、60h后进行药物干预，结果显示：24h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组代谢活性下降了66.3%，表明和厚朴酚可有效降低生物被膜内细菌的代谢活性（P<0.0001）；CHX组代谢活性下降了93.0%，CHX可有效降低生物被膜内细菌的代谢活性（P<0.0001）。和厚朴酚与CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。42h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组代谢活性下降了60.8%，和厚朴酚可有效降低生物膜内的细菌代谢活性（P<0.05）；CHX组代谢活性下降了91.0%，CHX可有效降低生物被膜内细菌的代谢活性（P<0.05）。和厚朴酚与CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。60h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组代谢活性下降了50.5%，和厚朴酚可有效降低生物被膜内的细菌代谢活性（P<0.05）；CHX组代谢活性下降了93.1%，CHX可有效降低生物被膜内细菌的代谢活性（P<0.0001）。和厚朴酚与CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。在受试菌株黏附阶段（24h）、聚集阶段（42h)以及成熟阶段（60h），和厚朴酚给药组抑制生物被膜细菌代谢活性的作用与生长对照组对比效果显著，与阳性对照组的效果仍有一定差距。和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜基质总量影响注：*表示和厚朴酚组与生长对照组比较，P＜0.05，**表示P＜0.001，***表示P＜0.0001；#表示和厚朴酚组与氯己定组比较，P<0.05。图3-2各药物组对具核梭杆菌生物被膜基质总量的影响图由图3-2可知，在受试菌株培养24h、42h、60h后进行药物干预，结果显示：24h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组的生物被膜基质总量下降了60.8%，和厚朴酚组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）；CHX组的生物被膜基质总量下降了95.0%，CHX组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）。和厚朴酚与CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。42h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组的生物被膜基质总量下降了40.7%，和厚朴酚组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）；CHX组的生物被膜基质总量下降了68.5%，CHX组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）。和厚朴酚与CHX相比，效果相近（P>0.05)。60h时，与生长对照组相比，和厚朴酚组的生物被膜基质总量下降了48.6%，和厚朴酚组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）；CHX组的生物被膜基质总量下降了72.3%，CHX组可有效抑制生物被膜总量（P<0.05）。和厚朴酚与CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。在受试菌株黏附阶段（24h）以及成熟阶段（60h），和厚朴酚给药组抑制受试菌株生物被膜总量的作用与生长对照组对比效果显著，与阳性对照组的效果仍有一定差距。而在受试菌株聚集阶段（42h），和厚朴酚给药组抑制受试菌株生物被膜总量的作用与生长对照组对比效果显著且与阳性对照组的效果相近。和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜微观形态的影响电镜图图3-3场发射扫描电镜观察生长对照组、和厚朴酚组以及氯己定组对具核梭杆菌生物被膜微观形态影响图由图3-3可知，生长对照组在24h、42h及60h三个阶段时呈正常细长、两端尖细如梭的形态，且细菌逐渐黏连、聚集，叠堆成团状。和厚朴酚处理后与生长对照组相比，细菌数量降低，且细菌之间的粘连程度也降低。与阳性对照组相比，和厚朴酚单独作用后，细菌量减少的程度、生物被膜的粘连程度以及黏附期、聚集期的整体效果与CHX组相近。由此可见，在和厚朴酚的作用下，生物被膜细菌之间的黏附减少，生物被膜结构破坏，菌体变形皱缩、凹陷。小结本章通过微量棋盘稀释法，确定了和厚朴酚对具核梭杆菌的最低抑膜浓度(MBIC)，并且使用该药物浓度对细菌生物被膜形成的三个阶段进行药物干预。采用CCK-8实验检测了和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜形成各阶段膜内细菌的代谢活性；采用结晶紫半定量黏附实验检测了和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜基质总量形成的影响；通过场发射扫描电子显微镜观察和厚朴酚对受试菌株生物被膜微观结构的影响，具体结果如下：通过微量棋盘稀释法测定了和厚朴酚对具核梭杆菌的MBIC为60μg/mL。通过CCK-8实验、结晶紫半定量黏附实验可知，和厚朴酚可有效降低具核梭杆菌生物被膜内活细菌的代谢活性以及基质总量。通过SEM场发射扫描电子显微镜可知，和厚朴酚可有效减少生物被膜的细菌量，并减少细菌之间的相互聚集以及胞外聚合物的形成。综上所述，中药单体和厚朴酚在具核梭杆菌生物被膜形成的不同阶段均有清除作用。结论与展望结论本文从抑制具核梭杆菌的生物被膜角度入手，对具核梭杆菌生物被膜体外模型的构建以及药物对生物被膜的干预作用两个方面进行了研究。通过本论文实验结果得知，中药单体和厚朴酚对具核梭杆菌的生物被膜形成具有良好的抑制作用。运用中药单体和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的药物干预作用是本课题的创新点，同时结论表明和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的形成有一定的抑制作用，一定程度上能削弱具核梭杆菌的耐药性。因此，这为中药单体和厚朴酚开发为一种新型的生物被膜抑制剂以及抗菌药物的研发提供了新的思路。展望本实验中药单体和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜具有一定抑制作用，但效果并未达到甚至超越阳性药物氯己定CHX对具核梭杆菌生物被膜的作用，由此得出单独和厚朴酚给药有一定的效果，但效果仍不如阳性药。因此可考虑通过联合用药增强药物疗效，并减少用量，探讨联合用药对具核梭杆菌生物被膜的抑制作用影响，同时与阳性药物组进行对照，由此佐证试验药物的有效性。本实验虽然验证了和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的形成有抑制作用，但其对生物被膜抑制的具体作用机制尚不清楚，可以计划在后续的实验中，加入探究和厚朴酚对具核梭杆菌生物被膜的群体感应、细胞毒力、相关基因mRNA