课件速览-细胞色素C的三氯乙酸沉淀

项目二细胞色素C的生产任务七细胞色素C的三氯乙酸沉淀严格遵守GMP和执行细胞色素C滤液的三氯乙酸（TCA）沉淀岗位SOP，以细胞色素C盐析过滤液为原料，对其滴加三氯乙酸有机溶剂，收集细胞色素C红色沉淀物，溶解供后续工序使用。规范填写生产记录。任务描述细胞色素C的三氯乙酸沉淀2任务支撑（一）细胞色素C滤液中加三氯乙酸的目的与作用

三氯乙酸能使细胞色素C沉淀，细胞色素C的等电点为10.5～10.8，加入三氯乙酸后，pH<pI，细胞色素C带正电荷，可与三氯乙酸形成不溶性盐；三氯乙酸作为变性剂使蛋白质构象改变，暴露较多疏水基团而聚集、沉淀。

蛋白质沉淀在短时内可发生可逆变化，经离心除三氯乙酸后，加水可溶解。本任务向盐析过滤液中按照12.5%体积滴加20%浓度的三氯乙酸，边滴边搅拌，至出现浑浊为止。加完后立即离心，倒去上清液；下层沉淀可加少量蒸馏水溶解，注意蒸馏水的量应刚好使沉淀完全溶解，避免加水过多，使细胞色素C浓度过低。3细胞色素C的三氯乙酸沉淀（二）有机溶剂沉淀法4通过往生物分子溶液中加入与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等），使生物分子在水中的溶解度显著降低而沉淀析出的方法，称为有机溶剂沉淀法。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高有机溶剂沉淀法概念及特点（二）有机溶剂沉淀法51.降低水溶液的介电常数。不同溶剂的介电常数不同，溶剂的介电常数越小，水溶性溶质的溶解度就会越小。向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减弱溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质等生物分子的相互作用力，增加生物分子间相互作用，导致溶解度降低而沉淀。有机溶剂沉淀法机理溶剂名称相对介电常数溶剂名称相对介电常数水78丙酮21甲醇31乙醚9.4甘油56.2乙酸6.3100%乙醇26三氯乙酸4.6部分溶剂的相对介电常数（二）有机溶剂沉淀法62.破坏生物大分子表面水化膜。由于蛋白质等生物大分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水分子相互作用形成水膜，包围蛋白质分子，削弱了蛋白质分子间的作用力，以胶体形式稳定存在于溶液中。在溶液中加入有机溶剂后，有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质等生物分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了水化膜，因而发生沉淀。有机溶剂沉淀法机理（二）有机溶剂沉淀法7水溶性要好介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中容易获取有机溶剂选择

沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂（二）有机溶剂沉淀法8有机溶剂选择乙醇最常用极易溶于水、沉淀作用强、沸点适中、无毒甲醇对蛋白质等生物分子的变性作用比乙醇、丙酮都小口服有强毒性异丙醇无色、有强烈气味的可燃液体对人体具有潜在的危害作用丙酮沉淀作用大于乙醇沸点较低，挥发损失大、对肝脏具有一定的毒性、着火点低丁醇适用于提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶亲脂性强，兼具亲水性pH及温度选择范围较广其他如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2，4-戊二醇等（二）有机溶剂沉淀法9式中，V为需加入纯有机溶剂的体积，L；V0为原溶液的体积，mL；S1为原溶液中有机溶剂的浓度，g/100

mL；S2为所要求达到的有机溶剂的浓度，g/100

mL。有机溶剂用量

上式未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况。如果有机溶剂浓度要求不太精确，可采用上式进行计算（二）有机溶剂沉淀法10制备较低浓度乙醇时，可参考乙醇及水的用量表有机溶剂用量制备较低浓度乙醇1L所需较高浓度乙醇及水的用量（mL，20℃）（二）有机溶剂沉淀法111.一般情况下，有机溶剂对身体具有一定的损害作用，在使用时采取好防护措施。2.高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。3.操作时的pH大多数控制在待沉淀生物分子的等电点附近。4.有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质等生物分子的溶解度，减少变性，提高分离的效果。5.用有机溶剂沉淀生物分子后，有机溶剂易除去，缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性，故操作时要求条件比盐析严格。有机溶剂沉淀的操作注意事项（二）有机溶剂沉淀法121.温度

使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10～-20℃；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行。影响有机溶剂沉淀效果的因素（二）有机溶剂沉淀法132.pH值：

pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。3.样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。4.中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。5.某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。影响有机溶剂沉淀效果的因素14胶体是物质以一定分散程度而存在的一种状态，即将一物质分成许多小粒子，然后分散在一种介质中即可得到的一种分散体系。在这种分散体系中，粒子叫分散质（或分散相），介质叫分散剂（或分散介质）。当分散质的直径为0.1µm～1.0nm时，这个体系就叫胶体。（三）凝聚、絮凝和混凝技术胶体15胶体颗粒的最内层称为胶核，其表面因吸附电位形成离子而带电。胶核通过静电引力作用吸附溶液中的反离子到其周围，构成胶体的双电层结构（三）凝聚、絮凝和混凝技术胶体双电层结构①吸附层。胶核表面的电位形成离子和其吸附的束缚反离子合称为吸附层。②扩散层。随着与胶核表面距离的逐渐增大，反离子浓度变小且有向溶液中扩散的趋势，故不随胶粒移动。这层反离子称为自由反离子，构成扩散层。③胶粒。胶核与吸附层合称胶粒。④胶团。胶粒与扩散层合称胶团。⑤滑动面。在胶粒与扩散层之间形成的滑动界面。⑥ζ电位。胶粒移动时滑动面与外层的电位差称为移动电位。ζ电位越高，扩散层越厚，胶粒带电量越大，带同性电荷胶体的胶体之间静电斥力越大，胶体颗粒越具稳定性。16①胶体的动力稳定性。胶体的动力稳定性是由布朗运动引起的。胶体颗粒尺寸很小，无规则的布朗运动强，对抗重力影响的能力强而不下沉，胶体颗粒均匀分散在水中而稳定。②胶体的带电稳定性。胶体的带电稳定性是由静电斥力引起的。静电斥力对抗范德华力，使胶体颗粒保持分散状态而稳定。③胶体的水化作用稳定性。亲水性胶体的水化作用来源于胶粒表面极性基团对水分子的强烈吸附，使胶粒周围包裹一层较厚的水化膜，阻碍胶粒相互靠近，胶体颗粒保持分散状态而稳定。（三）凝聚、絮凝和混凝技术胶体稳定性17凝聚是指在电解质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，由于胶粒之间双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定，发生的胶体粒子聚集现象。胶体脱稳后粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体。絮凝是指在某些高分子絮凝剂（天然的或合成的大分子量聚电解质）存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团。其中，絮凝剂主要起架桥作用。混凝是指同时包含了凝聚和絮凝技术的沉淀方法。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚、絮凝和混凝技术概念181.压缩双电层作用。加入含有高价态反离子的电解质后，高价态反离子通过静电引力进入到胶体颗粒表面，置换出胶体原来吸附的低价反离子，从而使双电层中的反离子数量减少，也就是双电层厚度变薄，即产生压缩双电层作用，使ζ电位降低。ζ电位降至0时（称为等电状态），此时排斥势能完全消失，从而胶体颗粒失去稳定性，产生凝聚作用。2.吸附-电中和作用。吸附-电中和作用是指胶粒吸附带有异种电荷的粒子，从而中和本身所带的部分电荷，减少了胶粒间静电斥力，使胶体颗粒更易于聚沉。胶粒先吸附电荷再电中和。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚、絮凝技术机理193.吸附架桥作用。吸附架桥作用常见于絮凝，是指高分子物质与胶粒的吸附与桥连。高分子链的一端吸附了某一胶粒后，另一端又吸附另一胶粒，形成“胶粒-高分子-胶粒”的絮凝体。投加高分子絮凝剂时，应避免出现以下两个现象：高分子投量过少，不足以形成吸附架桥；但投加过多，会出现胶体保护现象。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚、絮凝技术机理架桥模型胶体保护现象204.沉淀网捕作用。沉淀网捕作用是指投加到溶液中的铝盐、铁盐等混凝剂水解后形成大量具有三维立体结构的水合金属氧化物沉淀，当这些水合金属氧化物体积收缩沉降时，会像多孔的网一样，将溶液中胶体颗粒捕获卷扫下来，产生沉淀分离。沉淀网捕作用主要是一种机械作用，其混凝除浊效率不高。另外，无机盐还可以破坏水化层。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚、絮凝技术机理211.凝聚剂的种类工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有硫酸铝（明矾）、碱式氯化铝、三氯化铁、硫酸锌、碳酸镁等；常用的金属氧化物类凝聚剂有氢氧化铝、四氧化三铁、氢氧化钙、石灰等。2.絮凝剂的种类对带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子高分子絮凝剂，同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机制，所以可单独使用。对非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架，所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚剂和絮凝剂的种类222.絮凝剂的种类①有机高分子絮凝剂。有机高分子絮凝剂又称聚电解质，相对分子量由数千至1000万以上不等。常用的聚电解质有聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物。根据活性基团在水中解离情况不同，聚电解质可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。②无机高分子絮凝剂。无机高分子絮凝剂比传统凝聚剂效能更优异，比有机高分子絮凝剂价格低廉。目前，无机高分子絮凝剂有聚磷氯化铝（PPAC）和聚合硫酸铝（PAS）等。③（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚剂和絮凝剂的种类232.絮凝剂的种类③天然有机高分子絮凝剂。天然有机高分子絮凝剂包括壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。④微生物絮凝剂。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。其主要成分是糖蛋白、黏多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全、无毒和不污染环境。（三）凝聚、絮凝和混凝技术凝聚剂和絮凝剂的种类05040201生产前准备确定三氯乙酸用量沉淀的溶解清场任务实施2403沉淀离心细胞色素C的三氯乙酸沉淀1.确认与填写检查记录确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求；填写细胞色素C盐析清液的三氯乙酸沉淀产前检查记录；领用原辅料和耗材，领用生产用溶液。（一）生产前准备25（二）确定三氯乙酸用量26准确计量盐析所得清液的体积，按照每100mL清液加入12.5mL浓度20%三氯乙酸的比例计算三氯乙酸的用量，并填写记录。用离心机处理上述体系，收集沉淀。离心条件：3000r/min，15mim。（三）沉淀离心2.离心将盐析步骤所得清液置于适当容积的烧杯内，开启搅拌。在搅拌下缓慢加入工艺量的三氯乙酸，加入过程会有沉淀出现。加入完毕后，停止搅拌。1.三氯乙酸的加入27观察离心后的上清液，如上清液仍为红色，则需按照每100mL清液补加5mL浓度20%三氯乙酸的比例，重复1和2两个流程，继续收集沉淀。3.检查上清液（四）沉淀的溶解28取收集的沉淀，加入10mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，至沉淀溶解，得到粗品溶液，备用。（五）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。注意：请在任务实施过程中规范填写《细胞色素C的三氯乙酸沉淀操作记录》，不可补填和篡改！29知识学习反思与反馈学习成果实践操作考核与评价30拓展任务香菇多糖的提取纯化31查阅资料，了解香菇多糖的性质，理解热水浸提和乙醇沉淀香菇多糖的原理。查阅设计《香菇多糖的提取纯化操作记录》，在任务实施过程中同步填写。按照标准操作步骤，以水提醇沉法，对香菇子实体提取纯化香菇多糖。设计实操设计（一）任务描述32（二）实训材料1.材料、试剂香菇（取子