课件速览- 人干扰素α2b发酵液的处理

项目三人干扰素α2b的生产任务二人干扰素α2b发酵液处理1以发酵法制备的重组人干扰素α2b工程菌菌体为原料，实施菌体的溶解、破碎和洗涤等操作，收集得到人干扰素α2b包涵体。任务描述人干扰素α2b发酵液处理2任务支撑（一）处理发酵液中菌体的目的与作用以

溶菌酶初步破坏大肠埃希菌细胞壁结构，同时以DNA酶酶解释放出的DNA。然后，以高压匀浆法充分破坏细胞，将包涵体从菌体内释放至料液中。离心收集包涵体后，以低浓度变性剂尿素和温和去垢剂TritonX-100去除与包涵体粘连的膜蛋白或膜碎片。最后洗涤去除尿素和TritonX-100，将包涵体保存于适宜缓冲液中。人干扰素α2b发酵液处理3（二）细胞破碎技术4制药常用细胞细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(几丁质等)脂类蛋白质1.细胞破碎的阻力（二）细胞破碎技术52.细胞破碎的方法研磨（是否外加作用力）珠磨法渗透压法冻融法（二）细胞破碎技术6机械法--高压匀浆法

细胞悬浮液在高压作用下从针形阀高速（可达到450m/s）喷出，撞击碰撞环，被迫改变方向从出口管流出。细胞受到突然减压和高速撞击作用后，经历剪切、碰撞及由高压到常压的压力变化，在撞击力、剪切力和空穴效应等综合作用下破碎。操作压力通常为50～70MPa。压力、循环操作次数和高压均质机温度影响破碎效果。易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰阳性菌和含有包涵体基因工程菌，不宜采用该方法。项

目细胞壁的主要组分溶解用酶细菌革兰阳性菌：肽聚糖（占30%～90%）和磷壁酸等溶菌酶革兰阴性菌：肽聚糖（占5%～20%）、脂多糖和蛋白质等溶菌酶与螯合剂EDTA共同使用放线菌肽聚糖等溶菌酶植物细胞纤维素等纤维素酶和半纤维素酶真菌（如酵母菌）纤维素、葡聚糖、几丁质等蜗牛消化酶（含纤维素酶、几丁质酶和甘露聚糖酶等）酶溶法在细胞破碎中的应用（二）细胞破碎技术非机械法—酶溶法7什么是缓冲溶液？1.0mol/LKCl溶液水1.0mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液缓冲溶液是一种能对溶液的酸度起稳定（缓冲）作用的溶液。缓冲溶液具有缓冲作用。pH

7pH

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7（三）缓冲溶液的配制加入等量NaOH溶液的结果：√√√

8缓冲作用1.0mol/LKCl溶液+缓冲溶液水+缓冲溶液1.0mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液缓冲作用是指缓冲溶液抵抗少量外来酸碱，溶液中化学反应产生的少量酸碱或稍加稀释而溶液自身的酸度不会发生显著变化的性质。pH

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7（三）缓冲溶液的配制√√√9缓冲溶液的组成

缓冲溶液一般是由能发挥缓冲作用的一对物质组成的，通常称为缓冲对。HAc-NaAc弱酸及其盐NH3－NH4Cl弱碱及其盐NaH2PO4－Na2HPO4

酸式盐及其次级盐（三）缓冲溶液的配制10缓冲公式与缓冲范围缓冲范围：缓冲作用的有效pH范围。缓冲溶液公式：Ka体现缓冲对解离平衡的性质缓冲比为共轭碱与酸的比值缓冲范围为：pKa±1举例：H2PO4--HPO42-的pKa为7.21缓冲范围：pH6.21~pH8.21（三）缓冲溶液的配制11缓冲容量缓冲容量：描述缓冲溶液的缓冲能力的参数。符号：

缓冲溶液浓度越大，则可供消耗的抗酸或抗碱成分就越多，缓冲容量就越大。缓冲容量（β）的主要影响因素：（1）缓冲溶液浓度：浓度越高，β越大；（2）缓冲比：缓冲比为1（pH=pKa）时，β最大。（三）缓冲溶液的配制12缓冲溶液的配制缓冲公式计算配制缓冲溶液查阅缓冲溶液配制表缓冲溶液（三）缓冲溶液的配制pH（18℃）0.2mol/LNaAc（mL）0.2mol/LHAc（mL）pH（18℃）0.2mol/LNaAc（mL）0.2mol/LHAc（mL）3.60.759.354.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.902.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.86.400.60醋酸-醋酸钠缓冲液（0.2mol/L）配制表130504030201生产前准备初步溶解菌体的破碎洗涤清场任务实施人干扰素α2b发酵液处理141.确认与填写检查记录确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求。填写发酵液中菌体的处理产前检查记录。2.领料与溶液配制领取生产用试剂耗材物料并配液：（1）破菌缓冲溶液：pH为8.0，溶菌酶+核酸酶。（2）洗涤液Ⅰ：pH为7.5，EDTA-Na2+尿素+TritonX-100。（3）洗涤液Ⅱ：pH为7.5，Tris-HCl缓冲溶液。（一）生产前准备15取破菌后溶液，用电动搅拌器搅拌，至溶液中出现大量核酸。按比例加入1mol/L硫酸镁至终浓度2mmol/L，加DNA酶至终浓度0.01%（W/V），继续搅拌16～24h。（二）初步溶解2.溶解菌体取新制菌体或冻存菌体（待稍融化后使用），称量。置菌体于破菌缓冲溶液（破菌缓冲液与菌体湿重的用量比为10∶1）。1.量取菌体16将高压匀浆后料液离心，离心条件：4℃，6000rpm，25min。离心结束后弃上清，收集沉淀。称量沉淀质量。（三）菌体的破碎3.收集包涵体同时将将溶解菌体后料液定量置于高压均质机料斗内，每次装量3L左右。冰块置于高压均质机装料斗内，冷却破菌液。1.上料打开开关，拧紧二级阀，控制压力（6±2）MPa，达压力后拧紧一级阀，控制压力为（50±10）Mpa。1min后放料。根据镜检及粘稠感判断是否需再次破碎。视情况，再次破碎。2.破碎菌体17（四）洗涤将破菌缓冲溶液体积1/2的洗涤液Ⅱ加入沉淀，用电动搅拌器搅拌至沉淀完全悬浮或溶解，搅拌2.5h。离心去除洗涤液Ⅱ：4℃，6000rpm，25min。弃去上清液，收集沉淀，称重。置于包涵体储存瓶中，标明品名、日期，置于－20℃，最长保存期为1年。2.第二次洗涤将与破菌缓冲溶液等体积的洗涤液Ⅰ加入沉淀中，用电动搅拌器搅拌至沉淀完全悬浮或溶解，搅拌3h。离心去除洗涤液Ⅰ：4℃，6000rpm，25min。弃去上清液，收集沉淀。称重。1.第一次洗涤18（五）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。注意：请在任务实施过程中规范填写《人干扰素α2b发酵液处理操作记录》，不可补填和篡改！19知识学习反思与反馈学习成果实践操作考核与评价20拓展任务酶法破碎大肠埃希菌21查阅资料，熟悉大肠埃希菌细胞壁的结构及组成。查阅设计《酶法破碎大肠埃希菌操作记录》，在任务实施过程中同步填写。向大肠埃希菌悬浮液，加酶进行细胞破碎；以革兰结晶紫染色后用血球计数板计数，计算破碎率。设计实操设计（一）任务描述22（二）实训材料1.材料、试剂保藏的大肠埃希菌斜面；溶菌酶；碎冰；胰蛋白陈；酵母提取物；氯化钠；氯化钾；氢氧化钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；Tris；浓盐酸：EDTA；TritonnX-100；草酸铵；结晶紫

；95%乙醇；蒸馏水。2.仪器设备酸度计、冷冻离心机、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温摇床。23（三）实训操作0504030201配制溶液制备大肠埃希菌料液收集大肠埃希菌酶解大肠埃希菌菌体破碎率检查LB液体培养基PBS缓冲液Tris-HCl缓冲液溶菌酶裂解液革兰结晶紫染液菌种接种于LB液体培养基，以200r/min，37℃过夜培养（或18h）1℃，8000r/min离心10min，取沉淀，用PBS悬浮后，再4℃，反复用PBS洗涤，离心菌体2～3次。每克湿菌体加入10～20mL裂解液，混匀后冰水浴3h。破碎菌体前后分别取样，以革兰结晶紫染色，显微镜观察，计数破碎率。24清场11清场6（四）任务分析与总结1.为什么能够以酶法破碎大肠埃希菌？除了酶法外，还有哪些方法可用于大肠埃希菌，请简述这些方法破碎大肠埃希菌的原理。2.小组讨论：酶法破碎大肠埃希菌的步骤及操作要点，选取代表汇报讨论结果。3.选择题。（1）高压匀浆法不适