木霉固态菌种生产技术规程

DB32/TXXXX—2019木霉固态菌种生产技术规程范围本标准规定了木霉固态菌种生产中所涉及的生产场地要求、生产流程、产品检测、建立生产档案、包装及贮存运输要求等技术环节。本标准适用于木霉固态菌种的生产。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志GB3095环境空气质量标准GB3838地表水环境质量标准GB20287农用微生物菌剂NY/T883农用微生物菌剂生产技术规程术语与定义下列术语和定义适用于本文件。固态菌种solidspawn生长在固态培养基料上的菌种。微生物接种剂microbialinoculant一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用，或经浓缩或经载体吸附而成的活菌制品。固体培养基solidmedium以富含木质纤维素或淀粉类天然物质为主要原料，添加适量的有机氮源及无机盐类，具一定水分含量的培养基。生产场地要求生产基地选择生产基地应远离居住区、城区等，并且交通便利，生态环境优良，周边植被覆盖率高。生产地块集中连片并位于原料收集区较近的地方。车间保温保湿性能良好，同时具备通风性能。生产环境厂区空气质量达到大气环境质量标准GB3095中II类标准要求。发酵用水达到地表水质量标准GB3838中III类水质要求，冷却水及其他用水应达到标准IV类水质要求。生产车间原料库原料库要求水电方便，平坦干燥、通风良好，光照充足、空旷宽阔，远离火源，注意防火设施的建设。接种室接种室必须设缓冲间，通风和保温性能良好，并具有防尘换气性能，墙内壁和屋顶光滑，必须做好杀菌消毒工作，确保接种室环境的相对无菌。培养室培养室内壁和屋顶光滑，便于清洗与消毒，有条件的单位可以建设半地下室的培养室，或者将培养室墙壁加厚，有利于培养室的控温。检验室检验室宜留出便于检验仪器设备安装的场所，同时水电布局要求合理，建立车间环境卫生制度，定期对生产设备和环境消毒的。生产流程技术环节木霉固态菌种主要包括木霉高密度液体发酵、固体基质准备、接种木霉液体菌种、固体发酵的控制、固态菌种后处理、产品包装、质量检测及出厂等技术环节。具体工艺流程见附录A。菌种要求原种原种是生产用菌种的母种，对原种有如下要求：——原种应有菌种鉴定报告。——原种应有菌种的企业编号、来源信息等。菌种保管采用固体曲保藏和冻干管保藏的方法保藏木霉固体孢子，确保无杂菌污染，菌种不退化。分类纯化并定期检查，建立菌种档案。菌种质量控制在进行生产之前，应对所使用的菌种进行检查，并确认其纯度和性能没有发生退化，如出现污染或者退化情况，该菌种不能作为生产用菌种，应该按照标准NY/T883执行。液体发酵增殖木霉菌种的液体发酵增殖，按照NY/T883执行。具体的培养基见附录B。木霉菌丝体采用棉兰染色法观察：在载玻片中央滴加一滴无菌水，并将菌丝体均匀分布其中，盖上盖玻片，尽量不留气泡，从一侧滴加少量的棉兰染色液染色5min，染色结束后用无菌水慢慢冲洗染色液，表面风干后在显微镜下观察，染色液配方具体见附录C。菌丝清晰可见，生长良好，没有出现杂菌污染，可以作为菌种继续使用；如果菌丝细小并呈不规则分布或者有杂菌污染，应按标准NY/T883处理。固体培养基制备培养基要求发酵培养基要求接种后木霉菌丝体生长旺盛，在保证有一定的生物量（菌丝体）的前提下兼顾分生孢子及有效代谢产物的产生。原料要求来源充足、价格合理、营养成分充足，宜采用农作物秸秆及农用氨基酸作为主要原料。制备过程秸秆前处理以农作物秸秆作为发酵基质，使用前晾干（含水率约15%，含有机质约65%）并用粉碎机将其粉碎成0.3cm～0.4cm长的片段。氨基酸添加往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的添加量为每100g晒干后的秸秆加入100～200mL的氨基酸稀释液（氨基酸原液总氨基酸含量≥10%），调节起始pH为3.0～4.0，物料的含水率应该严格控制在50%～60%之间，陈化4h～6h后备用。灭菌高压蒸汽灭菌要求固体发酵培养基物料灭菌温度为121℃～130℃，灭菌时间为1.0h～2.0h；或者采用100℃灭菌2h～4h，24h后再灭菌一次。灭菌效果检测将1g固体发酵产物加入到9mL无菌水中，充分混匀后制成悬液，吸取1mL悬液加入到装有已灭菌的9mL营养肉汤的试管中，并做至少三个生物学重复，将试管置于37℃恒温培养箱中避光培养，24h内无浑浊、镜检无菌体后即可判定彻底灭菌，反之则判定为灭菌不彻底，不可用于固体发酵。接种固体发酵培养基高温蒸汽灭菌后，待其降至室温，尽快将灭好菌的固体发酵培养基转移至固体发酵培养室。将发酵好的木霉菌丝体按5%的接种量（v/w，鲜重）接种到固体发酵培养基料中并充分拌匀，分装到不同的浅盘当中，并将塑料浅盘转移到具有控温控湿功能的发酵室内进行培养。发酵控制培养温度固体发酵的温度应该严格控制在（28±2）℃，根据不同木霉发酵特性和生长代谢特征，适当调整到最佳的发酵温度。物料含水率固体发酵初期，最适宜的物料含水率应该控制在50%～60%之间，发酵结束后，发酵产品的含水率应该控制在20%～40%之间。空气湿度固体发酵过程中，空气湿度宜严格控制在70%～75%之间。发酵终点判断物理性状采用感观法评价固体发酵物料的颜色、形态和气味。孢子定量稀释涂布以无菌操作取样25g转至225mL无菌生理盐水中，并充分震荡后制成1：10的菌悬液。并利用梯度稀释法进行样品稀释，吸取最后的稀释液0.1mL于木霉选择性培养基上（见附录B），并用涂布棒将菌悬液涂布均匀。培养在28℃恒温培养箱中避光培养2d～3d，注意观察菌落的生长情况。计数——记录各平板的菌落总数，求出不同稀释度平板中的平均菌落数，计算出每克原始样品中的菌落数。——固体发酵产物中有效活菌数含量≥4.0×109个/克。产品检测有效活菌数检测按照5.7.2的方法检测发酵产物中的有效活菌数。杂菌率检测杂菌率的检测按照GB20287执行，木霉固体发酵产物的杂菌数应≤1.0×104个/克。其他项目检测固体发酵物的细度、有害元素含量（Hg、Pb、Cd、Cr、As）、pH（5.5～7.5）、大肠杆菌数、蛔虫卵死亡率值达到NY/T883的要求。建立生产档案每批次生产的产品，必须建立完善的生产档案，包括产品检验项目、检验结果、实验人、批准人以及检验日期等准确信息。包装及贮存运输要求包装包装标签按GB/T191规定执行。贮存产品应贮存于阴凉干燥处，环境温度不宜超过30℃，并避免与化肥、农药等一同贮存。运输在运输过程中应注意防潮、防晒、防破裂。

（规范性附录）

木霉固态菌种生产技术规程示意图

（规范性附录）

培养基及其配方原种培养基及其配方：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），其中马铃薯200g煮沸后取滤液，葡萄糖20g，琼脂25g，水1000mL，pH调整为5.0。摇瓶种子培养基及其配方：马铃薯葡萄糖液体培养基，其中马铃薯200g煮沸后取滤液，葡萄糖20g，水1000mL，pH调整为5.0。液体发酵培养基及其配方：土豆150kg/T、蔗糖15kg/T、玉米粉5g/T、(NH4)2SO45kg/T、MgSO4·7H2O0.5kg/T、KH2PO41kg/T、pH自然；pH调整为5.0。固体发酵培养基：农作物秸秆（优选水稻秸秆和玉米秸秆，含水率约15%，含有机质量约65%）晾干后用粉碎机将其粉碎成0.3cm～0.4cm长的片段；往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的添加量为每100g晒干后的秸秆加入100mL～200mL的氨基酸稀释液（相当于100g晒干后的秸秆中加入10mL～20mL的氨基酸水解液原液，氨基酸原液中总氨基酸的含量≥10%），调节起始pH为3.0～4.0，初始含水率严格控制在50%～60%之间，陈化4h～6h后备用（可以对秸秆进行预处理，更利于木霉利用秸秆）。木霉选择性培养基：蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20.0g/L，孟加拉红0.033g/L；上述培养基使用前，加入氯霉素0.1g/L，五氯硝基苯（75%可湿性粉剂）0.2g/L，