细菌的培养及鉴定

关于细菌的培养及鉴定标本采集原则1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.采样后立即送检6.送检标本应注明来源和检验目的第2页,共59页，2024年2月25日，星期天咳痰方法病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用3％～5％NaCl5ml雾吸约5min导痰以清晨第二口痰为佳标本采集后放置时间不超过2小时

第3页,共59页，2024年2月25日，星期天清洁中段尿液尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集标本后立即送检！第4页,共59页，2024年2月25日，星期天哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板—细菌药敏用TCBS平板—弧菌科细菌用沙包氏平板—真菌培养用真菌显色平板—真菌培养用罗氏培养基—分枝杆菌用常用的培养基种类和用途第5页,共59页，2024年2月25日，星期天临床标本培养基选择血：血培养瓶中断尿：血平板、mac平板脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麦康凯、SS、血平板第6页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环第7页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌接种法平板划线接种法：

★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。

★方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连续划线法：适用于含菌量较少的标本第8页,共59页，2024年2月25日，星期天分区划线法(3区)第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第9页,共59页，2024年2月25日，星期天连续划线法第10页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌培养法一般培养（需氧培养）：★培养温度：35℃（采用恒温培养箱）★培养时间：18～24h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等第11页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌在固体培养基中的生长现象菌落★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。第12页,共59页，2024年2月25日，星期天菌落第13页,共59页，2024年2月25日，星期天菌落与菌苔第14页,共59页，2024年2月25日，星期天菌落的三个类型：

1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又称S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又称R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又称M型第15页,共59页，2024年2月25日，星期天2024/4/416S型菌落第16页,共59页，2024年2月25日，星期天R型菌落第17页,共59页，2024年2月25日，星期天M型菌落第18页,共59页，2024年2月25日，星期天革兰染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。第19页,共59页，2024年2月25日，星期天革兰染色步骤

涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第20页,共59页，2024年2月25日，星期天固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。第21页,共59页，2024年2月25日，星期天

结晶紫1’

碘液1’

95%乙醇

30”

复红1’

冲洗滤纸干燥

油镜观察冲洗冲洗冲洗革兰染色程序初染媒染脱色复染第22页,共59页，2024年2月25日，星期天紫色（G＋）革兰氏染色步骤示意图革兰染色甲菌乙菌初染结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染稀释复红紫色（G＋）红色（G-）革兰染色步骤示意图第23页,共59页，2024年2月25日，星期天【结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌——紫色（G+b)阴性菌——红色（G-b)第24页,共59页，2024年2月25日，星期天G+球菌第25页,共59页，2024年2月25日，星期天显微镜下的杆菌G-杆菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells第26页,共59页，2024年2月25日，星期天痰标本涂片染色低倍镜下分类分级白细胞（个）上皮细胞（个）A>25<10B>25<25C<10>25A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本第27页,共59页，2024年2月25日，星期天革兰染色注意事项标本涂片不宜太厚固定不宜过热脱色不宜过度选用培养18--24小时菌龄的细菌为宜第28页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。第29页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸染色步骤

1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第30页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。

石炭酸复红维持3-5’

3%盐酸酒精30’’

~1’

美蓝复染1’

冲洗干燥

油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染第31页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸染色结果抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。第32页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸杆菌报告300个视野仅见到1—8条抗酸杆菌填写条数1+：镜检查见3-9条抗酸杆菌/100高倍镜视野2+：镜检查见1—9条抗酸杆菌/10高倍镜视野3+：镜检查见1-9条抗酸杆菌/高倍镜视野4+:镜检查见>9条抗酸杆菌/高倍镜视野第33页,共59页，2024年2月25日，星期天抗酸染色注意事项染色充分脱色时间宁长勿短在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热第34页,共59页，2024年2月25日，星期天临床标本培养基选择生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：

淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按《支原体培养的操作规程》操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板

第35页,共59页，2024年2月25日，星期天观察细菌在平板上的生长现象血平板：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性mac平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度巧克力平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度第36页,共59页，2024年2月25日，星期天2024/4/437革兰阴性菌葡萄球菌第37页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌的初步分类细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-杆菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。第38页,共59页，2024年2月25日，星期天金黄色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显β溶血环，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇血浆凝固酶和DNA酶阳性

第39页,共59页，2024年2月25日，星期天第40页,共59页，2024年2月25日，星期天2024/4/441葡萄球菌第41页,共59页，2024年2月25日，星期天第42页,共59页，2024年2月25日，星期天第43页,共59页，2024年2月25日，星期天念珠菌显色培养基

绿色—白色念珠菌蓝色—热带念珠菌白色—其他，细菌被抑制紫色—光滑粉色—克柔假丝酵母菌第44页,共59页，2024年2月25日，星期天第45页,共59页，2024年2月25日，星期天第46页,共59页，2024年2月25日，星期天嗜血杆菌的鉴定途径只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明革兰染色：G-小杆菌卫星实验就可以帮助初步鉴定第47页,共59页，2024年2月25日，星期天2024/4/448嗜血杆菌第48页,共59页，2024年2月25日，星期天奈瑟氏菌属鉴定在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落革兰染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对氧化酶和触酶都均为阳性第49页,共59页，2024年2月25日，星期天

奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈

菌和脑膜炎奈瑟菌最为重要第50页,共59页，2024年2月25日，星期天奈瑟氏菌属鉴定流程

菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状

氧化酶试验+触酶+

+麦芽糖--

脑膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第51页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌的鉴定与药敏第52页,共59页，2024年2月25日，星期天卫生部重点监控的6种MDRO

MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌—判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌—判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药

VER：耐万古霉素肠球菌—判断标准：对万古霉素耐药第53页,共59页，2024年2月25日，星期天ESBLs：产超广谱β内酰胺酶细菌。包括：大肠