艾滋病检测原理和技术规范

关于艾滋病检测原理和技术规范2024/4/32一、艾滋病与艾滋病病毒第2页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/33（有A～E多个亚型）与一种感染灰身白脸猴的猴免疫缺陷病毒（SIV）相似。HIV-1HIV-2Humanimmunodeficiencyvirus

HIV（有A～J，O1～O4多个亚型）与一种感染黑猩猩的猴免疫缺陷病毒（SIV）相似。第3页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/34艾滋病病毒感染后，可严重破坏人体的免疫系统，使人体丧失抵御各种疾病的能力，有利于各种病原体的侵入，从而导致各种严重的、难以治愈的机会性感染或肿瘤，最终导致死亡，病死率可达100％。第4页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/35HIV-1M组HIV-1O组HIV-2非洲中部和东部美国、欧洲、南美洲、非洲和亚洲南美洲、印度、赞比亚、中国非洲中部和东部泰国、中非、印度巴西、罗马尼亚、喀麦隆加蓬、苏联、尼日利亚、乌干达、塞内加尔、赞比亚喀麦隆、扎伊尔、中非塞浦路斯扎伊尔喀麦隆、加蓬HIV型别和亚型的分类进化与地区分布：西非、印度HIVABCDEFGHIJO1O2O3O4ABCDE第5页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/36基因亚型与感染途径的关系第6页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/37感染分期临床分期维持时间感染标志物传染性原发感染潜伏期潜伏期2-4周抗体阴性(窗口期)传染危险性高原发感染症状期急性HIV感染1-2周传染危险性高慢性感染潜伏期无症状HIV感染2－15年(平均8-10年)抗体阳性有传染性临床发病期艾滋病0－3年(平均1-2年)抗体阳性抗原阳性传染性强艾滋病从感染到发病的一般过程第7页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/38二、艾滋病检测的原理及方法第8页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/39临床诊断感染监测耐药监测治疗评价干预评估抗体检测抗体检测核酸定性CD4检测新感染检测CD4检测核酸定量核酸定量病毒分离基因测序核酸定性核酸定量各种检测技术为艾滋病防治工作提供广泛的技术支持平台第9页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/310检验标志物检验目的检验方法HIV(1+2)抗体筛查试验金标法、硒标法快速诊断试验明胶颗粒凝集试验(PA)

微孔板法酶联免疫试验（ELISA）第三代：双抗原夹心法第四代：增加检测P24抗原确证试验蛋白印迹法(WB)

手工/仪器病毒抗原早期诊断酶联免疫试验检测P24抗原病毒核酸临床诊断治疗评价定性试验

检测DNA定量试验

即病毒载量，检测RNACD4流式细胞仪法检测CD4+T淋巴细胞艾滋病实验诊断方法第10页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/311诊断试剂窗口期特点金标法、硒标法5周35天敏感性低，容易漏检明胶颗粒凝集试验(PA)5周35天特异性较好，敏感性不足ELISA（国产第三代）3周多20～25天普及，稳定性欠佳ELISA（进口第三代）3周18～22天较为成熟，稳定性好ELISA（进口第四代）2周多16～17天假阳性率偏高核酸检测1周多10～12天不用于常规诊断各种诊断试剂特性第11页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/312硒标法金标法HIV抗体筛查试验第12页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/313明胶颗粒凝集试验（Particleagglutinationtest，PA）

第13页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/314PA的操作和结果判断第14页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/3155

450/630nm下测定OD值混匀，加盖，37℃温育洗板3

加入底物第二次特异性结合4

加入终止液1

加入样品洗板2

加入酶标记物加盖，37℃温育加盖，37℃温育第一次特异性结合酶联免疫分析ELISA

（双抗原夹心、两步法）第15页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/316快速法可否单独使用？《全国艾滋病检测技术规范》（2004版）：将PA、dot-EIA、胶体硒法纳入快速检测规范方法，因此可以使用。有研究指出：任何一种快速试剂可以筛查出99%以上的阴性样本；两种快速试剂均为阳性时，可以筛查出98%以上的阳性样本；两种快速试剂结果不一致时，可用ELISA复检；单独使用或两种同时使用时，特异性差别无显著意义。第16页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/317■

针对各种病毒蛋白的特异抗体■

区分ELISA真阳性与假阳性■

检测HIV-1和HIV-2HIV抗体确证试验WesternBlot免疫印迹法第17页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/318基因名称代号功能基因产物片段HIV-1HIV-2结构基因外膜蛋白基因env合成外膜蛋白gp160gp120gp41gp140gp105

gp36

核蛋白基因gag合成核蛋白p55p24p18

p56p26p16

逆转录酶基因pol合成逆转录酶p65p51p31

p68p53p34调节基因反式激活因子tat加速病毒蛋白合成毒力蛋白表达调节基因rev促进整合的病毒选择性地产生调节蛋白或毒粒成份负调节因子nef减缓基因转录，使停止繁殖而处于潜伏状态毒粒感染性因子vif促进病毒感染另一个细胞HIV的主要基因及其产物

（HIV标志物）第18页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/319ss-RNA第19页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/320全自动免疫印迹仪第20页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/321HIV抗体阳性诊断标准：■2条env（gp160/gp120+gp41）■1条env+p24p55p66p31p51gp120gp160gp41p17p24膜蛋白（env）核蛋白（gag）逆转录酶（pol）第21页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/322筛查试验：诊断出阴性样本，并为阳性/可疑样本排除非特异条带。复检1（试剂A）：对阳性/可疑样本排除操作误差。复检2（试剂B）：对阳性/可疑样本排除试剂误差。确证试验：诊断出阳性样本。筛查试验和确证试验的作用第22页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/323临床分期流行病学临床表现实验室诊断潜伏期有明确感染史HIV进入血液未能检出任何标记物急性HIV感染有明确感染史上呼吸道感染症状颈、腋等淋巴结肿大头疼、皮疹、肝脾肿大后期抗-HIV阳转少数病例P24阳性CD4/CD8>1外周血WBC及淋巴细胞总数先降后回无症状HIV感染有明确感染史呈潜伏感染状态无任何症状及体征但免疫系统逐渐被破坏抗-HIV阳性，P24阴性CD4/CD8>1，CD4总数正常艾滋病有明确感染史全身淋巴结肿大持续低热>1个月慢性腹泻>4-5次/日3个月内体重下降>10%免疫功能低下多种机会性感染、肿瘤抗-HIV阳性，P24阳性CD4/CD8<1CD4总数正常<200/mm3（或200-500）外周血WBC、Hb下降有相关感染的病原学、肿瘤病理学依据HIV/AIDS

诊断标准

（GB16000-1995）第23页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/324AIDS指征性疾病

（美国CDC,1993,抗-HIV阳性及其中一种疾病即可诊断）气管、支气管、肺、食道的念珠菌病除肝、脾、淋巴结以外的CMV感染弥漫性或肺外的鸟外分支杆菌病并发失明的CMV性视网膜炎弥漫性或肺外的其它分支杆菌感染HSV所致的慢性口腔、呼吸道、食道炎症弥漫性或肺外的组织胞浆菌病侵润性宫颈癌弥漫性或肺外的球孢子菌病卡波济肉瘤肺外隐球菌病伯基特淋巴瘤肺部或肺外的结核病免疫母细胞型淋巴瘤原发性肺炎原发性脑淋巴瘤卡氏肺囊虫肺炎进行性多发性脑白质病慢性肠道隐孢子病（病程>1个月）脑弓形体病慢性肠道孢子球虫病（病程>1个月）HIV相关脑病反复发生的沙门氏菌败血症HIV相关的消瘦综合征第24页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/325HIV！HIV？HIV感染母亲所生婴儿：分别于12个月、18个月追踪检测阴性者为阴性，18个月仍阳性者为阳性。第25页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/326三、艾滋病检测技术规范第26页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/327主要内容：

样品采集和处理

检测方法（HIV抗体、病毒核酸、病毒载量、CD4、HIV抗原检测）

安全防护、职业暴露质量管理（质量保证、质量控制、质量评价）实验室质量考评

HIV诊断试剂质量评估第27页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/328筛查试验（试剂A）阳性／可疑均阴性均阳性阴性重复检测（试剂A+B）阴性阳性确证试验筛查实验室一阴一阳确证实验室复核检测（试剂A/B/C）阳性／可疑阴性筛查报告（阴性）确认报告（阴性）确认报告（阳性）第28页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/329检测方法检测结果检验报告处理筛查试验阴性HIV抗体阴性阴性告知阳性HIV抗体待复查上送确证确证试验阴性HIV抗体阴性（-）阴性告知阳性HIV抗体阳性（+）阳性告知，个案调查不确定HIV抗体不确定（±）告知，3个月后复查共2次HIV抗体检测结果处理规范第29页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/330HIV待确证样品HIV阳性确证报告原件感染者确认报告原件确认报告复印件备案筛查实验室所在单位筛查实验室所在单位确证实验室筛查实验室艾滋病样本确证、报告流程：第30页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/331认真填写各类表格（最好能打印），及时上报。第31页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/332各筛查实验室每月5日前上报上月检测数据：第32页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/333四、艾滋病检测的质量控制第33页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/334

行政支持

重视、投入、理解

实验室规范化建设

规范、制度、程序

人员要求

资质条件、培训和轮训质量保证（QA）质量控制（QC）

室内质控

质控图的建立和应用

检验期间核查

试剂对照、外部质控品对照、平行双样结果关联性（不同方法、不同实验室结果、人群特征等）可实时校验：样品、试剂、仪器、操作等环节。质量评价（EQA）

实验室室间质量考评第34页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/335■

建立各项规章制度和操作程序，定期检查；■人员定期接受培训和复训，培养良好的业务素质；对HIV实验室的10项基本要求第35页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/336■仪器设备运作正常，定期检定和校准，妥善维护；■样品流转有序，记录详细，保存规范；■采用合格试剂，经常核查试剂质量，正确保存和使用；■环境条件符合要求，有监控有记录；■严格按照规范和试剂说明书操作；■建立各类质量记录表格，资料保存完整，溯源性强；■坚持开展室内质控，参加室间比对和能力验证；■安全防护、废物处理措施落实，建立人员健康监护档案。第36页,共40页，2024年2月25日，星期天2024/4/337■每个实验室必须配备至少2种不同原理/不同厂家的试剂，其中一种必须是ELISA（第三代、双抗原夹心、两步法）。■第一次筛查试验推荐使用高敏感性的ELISA法，快速法可用于应急试验或复核试验。■按政府招标目录采购，保存供应商的资质证明文件，试剂批批检报告。■登记试剂采购和使用情况，注意保存条件并实行监控。■试剂和样品应分开存放，过期试剂必须及时处理