基因工程原理与技术-5课件

第五章聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)

PCR是体外快速扩增目标DNA序列的技术

1971年Khorana等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。

1983年Mullis发明了PCR技术。1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术。1989年PCR被美国《Science》杂志列为十余项重大科学发明之首。

1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖。

应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。

1编辑版pppt第五章聚合酶链式反应1编辑版pppt第一节PCR原理①遵循DNA体内复制原理，半保留式扩增；②扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为2kb左右；③扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段；④30~35个循环后，目标序列呈指数级扩增(2n-2)Cycle#12编辑版pppt第一节PCR原理Cycle#12编辑版pppt第二节PCR反应体系一、反应体系20μl

反应体系10×buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白)dNTP(各20~200μmol/L)模板DNA(0.1~2μg=105个分子)引物(各20~200pmol)MgCl2(0.5~2.5mmol/L)TaqDNA聚合酶(1~2.5U)无菌ddH2O3编辑版pppt第二节PCR反应体系20μl反应体系10×buff二、反应参数

预变性：94℃3~5min变性：94℃30~60S退火：38~65℃30~60S延伸：72℃1~2min

终延伸：72℃10min

30~35次循环4编辑版pppt二、反应参数预变性：94℃3~5m三、影响PCR的因素1、反应成分①引物；浓度、长度②DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量

③dNTP；浓度、比例④Mg2+；影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。

⑤反应缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。

⑥模板DNA。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。5编辑版pppt三、影响PCR的因素5编辑版pppt2、反应条件①变性的温度和时间；热启动降低非特异性扩增

②退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为Tm-5℃。退火温度越高，扩增特异性越高。

③延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的高低。对2kb长目标序列扩增时间多采用1min(72℃时)。6编辑版pppt2、反应条件6编辑版pppt四、平台效应

平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。

7编辑版pppt四、平台效应7编辑版pppt

引起平台效应的因素：

①dNTP或引物等消耗殆尽；

②酶活性逐渐降低；

③最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；

④非特异性产物与模板的竞争作用；

⑤在高产物浓度下产物变性不完全；

⑥低浓度的非特异产物开始大量扩增。

PCR的特点：

①灵敏度高

②简便、快速

③对样品纯度要求低

8编辑版pppt引起平台效应的因素：8编辑版pppt第三节聚合酶链式反应引物设计原则一、引物设计的总原则

提高特异性扩增，降低非特异性扩增。二、引物设计的一般原则①引物长度应为15~30个核苷酸，Tm接近72℃较佳；Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2

②引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构；

③G＋C碱基的含量在45％~55％左右；

④引物3’端必须与模板互补，5’端可以不互补⑤引物中连续互补碱基应小于4个；⑥引物间连续互补碱基应小于4个。

9编辑版pppt第三节聚合酶链式反应引物设计原则9编辑版pppt三、引物3’端的末位碱基

引物3’端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若为G或C，则引发率居于其间。当然，设计简并引物时，3’端末位碱基选T会得到较好的效果。四、引物设计软件Oligo6.57

Primer5.0

10编辑版pppt三、引物3’端的末位碱基10编辑版pppt第四节PCR的类型一、已知DNA序列的PCR扩增1、巢式PCR

不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，

引物1引物225个循环引物3引物425个循环11编辑版pppt第四节PCR的类型引物1引物225个循环引物3引物42、热巢式PCR

第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出106个细胞中的一个DNA分子。

3、半巢式PCR

(见下图)引物1引物225个循环25个循环引物1引物312编辑版pppt2、热巢式PCR引物1引物225个循环25个循环引物1引物34、不对称PCR采用两种不同浓度的引物(50:1)。主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针。高浓度引物低浓度引物13编辑版pppt4、不对称PCR高浓度引物低浓度引物13编辑版pppt5、等位特异性PCR

用于检测点突变。在引物的3’端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸。6、竞争引物PCR

用于检测特定位点的点突变。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个是突变引物，而且突变碱基在引物中间，其扩增产物相差20倍以上。由于一个引物被标记，能检测出不同样品的的扩增差异。

常为A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。14编辑版pppt5、等位特异性PCR14编辑版pppt7、降落PCR

在一次PCR中，设计多循环反应的程序，第一个程序的退火温度高于Tm，以后每个程序的退火温度逐渐降低，确保第一次扩增的特异性，这样后面的低退火温度不会影响扩增的特异性，因为在开始的几个循环中，目标产物已指数级扩增。常用于根据氨基酸序列设计简并引物的扩增、多基因家族成员的扩增。

15编辑版pppt7、降落PCR15编辑版pppt二、逆转录PCR(RT-PCR)逆转录PCR是指先以mRNA，以oligo(dT)n为引物在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后用已知一对引物扩增cDNA片段的技术。主要用于基因表达、cDNA克隆、逆转录病毒鉴定等研究。反转录PCR16编辑版pppt二、逆转录PCR(RT-PCR)反转录PCR16编辑版ppRT-PCR引物设计原则：

①引物限定区最好为180~500bp；②引物5’和3’端不应存在回文序列结构；

③用oligo(dT)n作逆转录第一链cDNA的引物时，有义引物应尽量位于RNA的3’端；④在引物限定区内，基因组DNA最好有一内含子，这样可检测污染情况；⑤PCR引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物；

17编辑版ppptRT-PCR引物设计原则：17编辑版pppt三、快速扩增cDNA末端(RACE，锚定PCR)杂合引物:17ntoligo(dT)(锚定引物)+带限制酶位点的序列。基因特异引物5’RACE的缺点：不能获得真正的5’末端。因为过早终止第一链cDNA像全长cDNA一样，可被末端转移酶同样有效地加尾。

3’RACE5’RACE18编辑版pppt三、快速扩增cDNA末端(RACE，锚定PCR)杂合引物:新5’RACE(加帽法)杂合引物RNA、RNA连接酶5’RACE烟草酸性焦磷酸酶

19编辑版pppt新5’RACE(加帽法)杂合引物RNA、RNA连接酶5’RA四、已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增1、反向PCR

酶切位点已知序列酶切稀释并分子内连接引物PCR在已知序列内酶切PCR20编辑版pppt四、已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增酶切位点已知序列酶切稀2、锅柄PCR

酶切、磷酸酶处理连接单连引物加Taq酶和dNTP，变性链内复性（稀释）链延伸链延伸巢式PCR已知序列引物巢式PCR21编辑版pppt2、锅柄PCR酶切、磷酸酶处理连接单连引物加Taq酶和dN五、未知序列PCR扩增1、差异显示PCR

锚定引物N9：随机引物22编辑版pppt五、未知序列PCR扩增锚定引物N9：随机引物22编辑版ppp2、减法PCR例如：受试者为感病材料；驱动者为正常材料23编辑版pppt2、减法PCR例如：受试者为感病材料；驱动者为正常材料23编六、荧光定量PCR(实时定量PCR)荧光染料(EB)：结合双链DNA会使荧光增强，但结合无特异性。

荧光标记探针(见图)：利用Taq酶的外切酶活性，扩增时切断探针释放出荧光基团，使荧光增强。特异性强

用途：检测病原菌、基因表达。

R：荧光基团；Q：淬灭基团24编辑版pppt六、荧光定量PCRR：荧光基团；Q：淬灭基团24编辑版p第五节PCR技术应用一、基因克隆及筛选二、基于PCR分子标记RAPD、SSR、AFLP等，应用在遗传图谱构建、生物进化、遗传多样性等方面的研究。三、DNA测序四、突变检测五、基因表达检测六、病原菌检测与疾病诊