微生物-显微镜和显微技术-课件

§2显微镜和显微技术14/3/2024§2显微镜和显微技术14/2/202424/3/202424/2/2024精品资料3精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”44借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。54/3/2024借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验显微镜的种类和原理显微观察样品的制备64/3/2024显微镜的种类和原理显微观察样品的制备64/2/2024一、显微镜的种类和原理(一)、光学显微镜普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。74/3/2024一、显微镜的种类和原理(一)、光学显微镜普通光学显微镜暗普通光学显微镜的几个基本概念84/3/2024普通光学显微镜的几个基本概念84/2/202494/3/202494/2/2024104/3/2024104/2/2024114/3/2024114/2/2024124/3/2024124/2/20241、普通光学显微镜由三部分构成①照明系统：包括光源和聚光器；②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置：用于固定材料和观察方便134/3/20241、普通光学显微镜由三部分构成134/2/2024油镜使用光镜使用方法144/3/2024油镜使用光镜使用方法144/2/20242、暗视野显微镜原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。适用范围：生活细菌运动性观察。

154/3/20242、暗视野显微镜原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。暗视野显微镜的使用164/3/2024特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。暗视野显基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。3、相差显微镜相差显微镜使用174/3/2024基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态适用范围：对透明的活体进行直接观察184/3/2024微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态适用范围：对透明的活4、荧光显微镜原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体194/3/20244、荧光显微镜原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见绿色：铜绿假单胞菌黄色：蜡样芽孢杆菌绿色：微管红色：微丝蓝色：核204/3/2024绿色：铜绿假单胞菌黄色：蜡样芽孢杆菌绿色：微管204/21931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2纳米。

（二）电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜214/3/20241931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。（二）1、透射电子显微镜目前TEM的分辨力可达0.2nm。用电子束作光源，用电磁场作透镜。用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。放大倍数最高可达近百万倍.由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。224/3/20241、透射电子显微镜目前TEM的分辨力可达0.2nm。224/高尔基体的TEM照片(伪彩色)234/3/2024高尔基体的TEM照片(伪彩色)234/2/2024244/3/2024244/2/20242、扫描电子显微镜扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。主要用于：样品表面结构254/3/20242、扫描电子显微镜扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图工作原理：扫描电子显微镜原理264/3/2024扫描电子显微镜原理264/2/2024274/3/2024274/2/20243、扫描隧道显微镜（STM）扫描隧道显微镜拍摄的7个铀原子团284/3/20243、扫描隧道显微镜（STM）扫描隧道显微镜拍摄的7个铀原子团294/3/2024294/2/20244原子力显微镜304/3/20244原子力显微镜304/2/2024314/3/2024314/2/2024特点光学显微镜电子显微镜最高放大倍数约1000-150010万以上最佳分辨率0.2微米0.5纳米辐射源可见光电子束辐射源通过的媒介空气高真空透镜类型玻璃电磁体反差来源光吸收的差异或特定波长电子散射聚焦机械机械调节透镜位置调节电磁透镜的流向改变放大倍数的方法调换物镜或目镜调节电磁透镜的流向样品承载载玻片金属网（通常为铜网）光学显微镜和电子显微镜的特点比较324/3/2024特点光学显微镜电子显微镜最高放大倍数约1000-150010（一）光学显微镜制样活体观察染色压滴法悬滴法菌丝埋片法活菌死菌美蓝染色简单染色鉴别染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、显微观察样品的制备334/3/2024（一）光学显微镜制样活体观察染色压滴法悬滴法菌丝埋片法活菌死（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。光学显微镜样品制备－－活体观察特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察

344/3/2024（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。光学显微镜用途：微生物的细致形态和结构染色前需要对样品固定.常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定光学显微样品制备－－染色观察354/3/2024用途：微生物的细致形态和结构光学显微样品制备－－染色观1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察364/3/20241)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检3（二）、电子显微镜的制样样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。374/3/2024（二）、电子显微镜的制样374/2/2024※1、透射电镜的样品制备负染技术投影技术超薄切片技术冰冻蚀刻技术384/3/2024※1、透射电镜的样品制备负染技术投影技术超薄切片技术冰冻蚀刻负染法将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映样品的内部结构。负染法原理394/3/2024负染法将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染负染色法观察的鞭毛用途：可以观察细菌细胞、病毒等。404/3/2024负染色法观察的鞭毛用途：可以观察细菌细胞、病毒等。404/2在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。投影法414/3/2024在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这投影法观察的噬菌体用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒424/3/2024投影法观察的噬菌体用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒424/2这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。样品固定→脱水→包埋→切片。只有在20—100纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法观察的一种厌氧弧菌434/3/2024这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。超样品-196℃迅速冷冻→加温到-100℃→切割样品→升华(真空)掉断口处的冰→重金属喷镀断口表面→电子显微镜观察冰冻蚀刻法444/3/2024样品-196℃迅速冷冻→加温到-100℃→切割样品→升华(真冰冻蚀刻法制备的酵母菌内部结构图优点:可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。454/3/2024冰冻蚀