荧光检测原理

关于荧光检测原理荧光PCR？

荧光标记扩增产物动态监测荧光信号变化第2页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光染料光能热能转移给临近的分子第3页,共49页，2024年2月25日，星期天

荧光标记信号的产生

荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光第4页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光信号荧光染料直接结合扩增产物SYBRgreenI——特异性结合双链，释放荧光信号荧光标记引物特异性荧光探针Taqman双荧光标记探针molecularBeacon荧光标记探针荧光标记杂交双探针第5页,共49页，2024年2月25日，星期天SYBRGREENI第6页,共49页，2024年2月25日，星期天FRET？

当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。第7页,共49页，2024年2月25日，星期天Taqman？特异性荧光双标记探针Taq酶5’→3’外切酶活性第8页,共49页，2024年2月25日，星期天Molecularbeacon？第9页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光标记杂交双探针变性退火延伸第10页,共49页，2024年2月25日，星期天CT值—样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数第11页,共49页，2024年2月25日，星期天对数期分析与终点分析的比较第12页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光PCR重现性第13页,共49页，2024年2月25日，星期天标准曲线→定量第14页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理采用dUTP—UNG酶的防污染系统，有效降低污染机会即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果第15页,共49页，2024年2月25日，星期天PCR荧光双检多检试剂第16页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光双检多检检测试剂原理针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶DNA，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。特点一次性处理样品一次性反应一次性给出2种或2种以上病原体检测结果两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰第17页,共49页，2024年2月25日，星期天竞争性荧光内标(IC)定量PCR技术第18页,共49页，2024年2月25日，星期天竞争性荧光内标(IC)什么是IC?

Internalcontrol简称IC，通常是指与靶序列十分相似的一段DNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。IC的作用

监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。第19页,共49页，2024年2月25日，星期天内标工作原理图第20页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR的临床应用早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证输血源的筛选母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断第21页,共49页，2024年2月25日，星期天疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。第22页,共49页，2024年2月25日，星期天病毒感染窗口期的NAT检测第23页,共49页，2024年2月25日，星期天病情评估和预后判断通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。第24页,共49页，2024年2月25日，星期天对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。抗病毒药物疗效的观察、指导第25页,共49页，2024年2月25日，星期天ALTAnti-HBsMonthsafterStartofTherapy0NormalAltBeforetherapy1234561224DNAHBeAgHBsAgSustainedResponsetoIFNTherapy

*HoofnagelpaperCHRONICHEPATITISB

第26页,共49页，2024年2月25日，星期天CHRONICHEPATITISB

ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治疗前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapy第27页,共49页，2024年2月25日，星期天

不同剂量IFN-a单次给药后HCV-1型病人

病毒滴度变化的定量监测（N=32）Lametal-Hepatol26:226,1997Baseline24hours48hoursgenomes/mlx1million0246810121410MIU5MIU3MIU第28页,共49页，2024年2月25日，星期天新药验证

任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。第29页,共49页，2024年2月25日，星期天拉米夫定抑制血清HBVDHA0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBVDNA;中位%变化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据第30页,共49页，2024年2月25日，星期天遗传疾病的早期诊断荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。第31页,共49页，2024年2月25日，星期天突变检测原理

锚探针突变探针突变探针Tm值较锚探针低5℃不完全配对完全配对第32页,共49页，2024年2月25日，星期天突变检测原理不完全配对完全配对温度低 中 高第33页,共49页，2024年2月25日，星期天FactorV点突变检测第34页,共49页，2024年2月25日，星期天ForwardPrimerReversePrimerDNACGCCGCLCRed640

LCRed705

扩增子HybprobePair1HybprobePair2双点突变的检测原理第35页,共49页，2024年2月25日，星期天双位点双色检测WithoutcccWithcccMut1+Mut2WT1+WT2Het1+Het2H20F2F3第36页,共49页，2024年2月25日，星期天母婴传播的监控

荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。第37页,共49页，2024年2月25日，星期天肿瘤的诊断荧光PCR的作用：可对原癌基因的突变和易位等作出检测。可对原癌基因的mRNA进行定量分析。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。探索癌变发生机理的研究提供参考。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。第38页,共49页，2024年2月25日，星期天荧光PCR在血液筛查中的应用第39页,共49页，2024年2月25日，星期天NAT(NucleicAcidAmplificationTesting)NAT应用于血液筛查的意义血液筛查现状筛查方法：免疫学输血危险性来源：窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误NAT可显著缩短窗口期，提高输血安全性HBV：缩短6-15天HCV：缩短41-60天HIV：缩短10-15天第40页,共49页，2024年2月25日，星期天急性感染时期HIV的标志物第41页,共49页，2024年2月25日，星期天急性感染时期HCV的标志物第42页,共49页，2024年2月25日，星期天急性感染时期HBV的标志物第43页,共49页，2024年2月25日，星期天病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解荧光信号检测核酸纯化系统多通道荧光PCR自动检测系统荧光PCR检测流程自动加样第44页,共49页，2024年2月25日，星期天多样本混合（Minipool）规格：16-96donations“Pool”是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。“Pool”的规格取决于临界阳性和所用NAT试剂的检测限度。(据文献，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000IU/ml，约1.35~2.4×104geq/ml;目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000copies/ml)筛查方法：递减法矩阵法第45页,共49页，2024年2月25日，星期天递减法第46页,共49页，20