蛋白质双向电泳及质谱技术

关于蛋白质双向电泳及质谱技术蛋白质双向电泳技术第2页,共64页，2024年2月25日，星期天双向电泳简介2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术。第一向—等点聚焦(IEF)pH梯度载体pI第二向—十二烷基硫酸钠(SDS) SDS作为变性剂和助溶剂分子量第3页,共64页，2024年2月25日，星期天样品等点聚焦(第一向)双向电泳的基本原理与流程示意分子量pH梯度(pI)SDS两性电解质pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向第4页,共64页，2024年2月25日，星期天双向电泳具体步骤样品制备缓冲液的配制IPG条重泡涨及上样第一向：IEFIPG条平衡平衡缓冲液Ⅰ(还原)平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)第二向：SDS胶条染色成像及图像分析第5页,共64页，2024年2月25日，星期天为什么要进行样品制备目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。？第6页,共64页，2024年2月25日，星期天1保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。2最大限度减少样品的损失低温保存样品(一般需低于-86℃)尽量缩短处理时间除盐，省略不必要的过程保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。样品制备原则第7页,共64页，2024年2月25日，星期天样品制备流程及注意事项溶解预处理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分级富集除杂第8页,共64页，2024年2月25日，星期天样品的破碎原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解样品的来源易碎的细胞坚硬的组织植物细胞真菌方法温和剧烈第9页,共64页，2024年2月25日，星期天温和破碎法渗透压冲击(培养的细胞)低渗液中的悬浮细胞反复冻融法(细菌)液氮冷冻去污剂降解(酵母、霉菌)降解缓冲液(含尿素和去污剂)SDS(应在IEF前去除)酶降解(植物、细菌、真菌)溶菌酶(细菌)纤维素酶，果胶酶(植物)溶壁酶(酵母)第10页,共64页，2024年2月25日，星期天剧烈破碎法超声破碎(细胞悬浮液)需以冰冷却避免过热弗式细胞压碎器(Frenchpressurecell，带壁微生物细胞在剪切力作用下破碎研磨(固体组织，微生物)液氮中将固体组织磨成细粉末样品研磨器(用于少量样品的处理)用于精确样品珠磨法(胞悬液，微生物)通过磨珠研磨破坏细胞壁第11页,共64页，2024年2月25日，星期天作用去除杂质浓缩样品抑制蛋白酶活性关键-可溶性获得可以重新溶解的蛋白常用方法硫酸铵沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸铵/甲醇/苯酚抽提样品的沉淀

对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱)第12页,共64页，2024年2月25日，星期天样品中杂质的去除去除原则尽量不丢失蛋白减少蛋白的修饰杂质的主要种类DNA/RNA脂质多糖盐离子去污剂其他固体杂质

第13页,共64页，2024年2月25日，星期天DNA/RNA的去除样品中含核酸的不利影响能被银染色法染色在凝胶酸性部分产生水平条纹当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase处理超声(机械破坏)、超高速离心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)第14页,共64页，2024年2月25日，星期天其他杂质的去除脂质使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH盐使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮离子去污剂如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，TritonX-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%固体杂质阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦过滤第15页,共64页，2024年2月25日，星期天样品的溶解2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一溶解的目标样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态第16页,共64页，2024年2月25日，星期天增加样品溶解性的手段变性剂改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性剂溶解疏水基团离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等还原剂使变性蛋白进一步伸展溶解含自由巯基的DTT或

-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)起载体作用的两性电解质到达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH捕获样品中少量盐分浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低)第17页,共64页，2024年2月25日，星期天样品液的准备标准液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚蓝见下表0.2%两性电解质载体385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量试剂第18页,共64页，2024年2月25日，星期天IPG

用两亲性电解液的组成250

l25

l20%8-10125

l12.5

l40%7-97-10250

l25

l40%5-85-8125

l12.5

l40%4-6250

l25

l40%3-53-6125

l12.5

l40%5-7125

l12.5

l40%4-64-7250

l25

l40%3-103-10样品溶液体积(/5ml)样品溶液体积(/5ml)两亲性电解液浓度(w/v)两亲性电解液范围IPG胶pH范围第19页,共64页，2024年2月25日，星期天样品制备注意事项

蛋白质水解低温Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质蛋白抑制剂特殊样品的制备低丰度蛋白的分离预分级窄pH胶(<2个pH单位)强碱性蛋白(如核糖体)的处理预处理富集特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦极端分子量蛋白的处理小于8kD对流混合，产生绒毛状或模糊的带大于200kD的蛋白，变性为多肽第20页,共64页，2024年2月25日，星期天梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)胶条的制备ACBFED酸碱

pH3pH10第21页,共64页，2024年2月25日，星期天固定pH梯度(IPG)示意图聚丙烯酰胺凝胶CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺单体酸缓冲基团：碱缓冲基团：NH3+R

第22页,共64页，2024年2月25日，星期天宽pH梯度及窄pH梯度宽pH梯度用于：

全部蛋白(确定感兴趣蛋白的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加载样能力以检测、分析更多蛋白

第23页,共64页，2024年2月25日，星期天IPG胶的重泡涨及上样2-DE样品重泡涨溶液重泡涨溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG缓冲液

(两亲性电解液)0.28%DTT微量

溴酚蓝IPG胶条支架IPG

胶条定位泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内第24页,共64页，2024年2月25日，星期天蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度样品的复杂度复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围预试验确定先宽后窄先线性后非线性先短后长第25页,共64页，2024年2月25日，星期天第一向：等点聚焦1.放置电极垫

(?)2.200V

维持

1.5h3.500V维持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh时间电压支架盖IPG

胶条电极电极垫第26页,共64页，2024年2月25日，星期天IPG

胶条的平衡

平衡液6M尿素和30%甘油减少电内渗第一步平衡加DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化第27页,共64页，2024年2月25日，星期天

使被分离的蛋白质与SDS完整结合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚蓝SDSSDSSDS向电泳缓冲液中加

0.5%的琼脂糖SDS标记纸片IPG胶条第28页,共64页，2024年2月25日，星期天胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍可实现PAGE的无背景染色会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果胺基黑染色转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色银染可减少胶内蛋白质产量对某些种类的蛋白质染色效果差对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响染色方法第29页,共64页，2024年2月25日，星期天银染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M柠檬酸5%乙酸25%甲醇第30页,共64页，2024年2月25日，星期天负染主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性不能用于膜上染色适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析胶体扩散染料主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质灵敏度与PAGE胶内的银染类似不用于胶内染色染色方法第31页,共64页，2024年2月25日，星期天有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质金属螯合染料与现代蛋白质组学研究相兼容的专门与常用微量化学表征过程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合染色方法第32页,共64页，2024年2月25日，星期天凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立2-DE分离的可溶性

E.coli蛋白第33页,共64页，2024年2月25日，星期天目前双向电泳需解决的问题样品的制备及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白)难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白)载样量的提高初步分离低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白定量分析灵敏度及可重复性第34页,共64页，2024年2月25日，星期天对于双向电泳的建议首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率第二向采用梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白第35页,共64页，2024年2月25日，星期天蛋白质质谱技术第36页,共64页，2024年2月25日，星期天质谱基础

样品离子源质量分析器离子检测器固体液体蒸汽形成离子(带电分子)电离质量分选(过滤)检测根据m/z分选离子数据处理质谱检测离子基本步骤:1.样品离子化2.根据质量(m/z)不同分离离子3.检测每种质量离子的数目4.收集、处理数据得到质谱图第37页,共64页，2024年2月25日，星期天质谱的评价指标质量范围速度灵敏度分辨率精确度第38页,共64页，2024年2月25日，星期天+++自由漂移区检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针激光335nmm/z相对强度MH+MH+MH+特点：灵敏度高准确度高分辨率高质量范围广图谱简明速度快第39页,共64页，2024年2月25日，星期天ESI四级杆质量分析器碰撞室反射器MCP检测器碰撞气体串联质谱法(MS/MS)ESI-Q-TOF质谱仪步骤：1质量分析

2碰撞(离子裂解)3质量分析TOF质量分析器第40页,共64页，2024年2月25日，星期天强的抗背景干扰能力极高的检测灵敏度和准确度可用来分析复杂混合物中的蛋白质丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质串联质谱的优点第41页,共64页，2024年2月25日，星期天1、鉴定和注释蛋白质的路线

通过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定鸟枪法蛋白质组学第42页,共64页，2024年2月25日，星期天

1234.5396

783.9147375.2561多肽已测得质谱数据或理论质谱数据MALDI-TOF检测的多肽指纹

胰酶消化凝胶蛋白质数据库?123比较:??是否相同

??质谱3235.2256第43页,共64页，2024年2月25日，星期天

肽质谱指纹图在数据库中匹配

不成功的可能原因样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。第44页,共64页，2024年2月25日，星期天

操作中角蛋白或其他蛋白质的污染蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多未知的新蛋白质数据库规模太小续：第45页,共64页，2024年2月25日，星期天氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库？查询串联质谱图从头测序输入输出序列片段PNT①②③串联质谱鉴定多肽的计量方法第46页,共64页，2024年2月25日，星期天组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术精确鉴定蛋白质第47页,共64页，2024年2月25日，星期天2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略

原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。

第48页,共64页，2024年2月25日，星期天3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的质谱鉴定基本步骤：第49页,共64页，2024年2月25日，星期天(1)亲和层析耦联质谱技术

基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。第50页,共64页，2024年2月25日，星期天先决条件得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（bait）

获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质第51页,共64页，2024年2月25日，星期天利用含靶蛋白的融合蛋白获得

相互作用蛋白质谷胱甘肽S转移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白第52页,共64页，2024年2月25日，星期天主要优点

灵敏度高：高浓度靶蛋白候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等检测多亚基蛋白质之间的相互作用第53页,共64页，2024年2月25日，星期天(2)免疫共沉淀耦联质谱技术

原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。

第54页,共64页，2024年2月25日，星期天研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀SDS分离免疫沉淀复合物切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签搜索数据库第55页,共64页，2024年2月25日，星期天特点

生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用

第56页,共64页，2024