无梗五加根化学成分的分离、分析和四种木脂素成分的药动学研究

无梗五加根化学成分的分离、分析和四种木脂素成分的药动学研究无梗五加Acanthopanaxsessiliflorus(Rupr.Et.Maxim)Seem.为五加科五加属植物,主产于中国、韩国和日本等地,《中华本草》记载其药用部位根皮为五加皮的来源之一,具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、活血脉的功效。本论文以无梗五加根为研究对象,分别从化学成分分离鉴定、UPLC-MS/MS分析、指纹图谱分析、含量测定和药物动力学五方面进行了研究,现分述如下：一、无梗五加根化学成分的分离和鉴定研究采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex-LH20柱色谱、ODS开口柱色谱及制备液相色谱等分离技术,从无梗五加根70%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇萃取层中分离得到了29个化合物,并通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。其中木脂素及其苷类化合物12个：分别为细辛脂素(2),芝麻脂素(3),赛菊宁黄质(4),洒维宁(5),台湾脂素C(6),台湾脂素E(7),7,7’-二氢台湾脂素C(8),杜仲树脂酚(9),松脂醇二葡萄糖苷(10),丁香脂素(11),无梗五加苷B(12),无梗五加苷D(13)；有机酸类化合物14个：分别为.3-ethyl-5-hydroxy-3-(hydroxymethyl)pentyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate(1),咖啡酸甲酯(14),原儿茶酸(15),原儿茶酸甲酯(16),对羟基桂皮酸(17),咖啡酸(18),二十三烷酸(21),1-咖啡酰奎宁酸(23),绿原酸(24),新绿原酸(25),1,3-二咖啡酰奎宁酸(26),异绿原酸B(27),异绿原酸A(28),异绿原酸C(29);甾体及其苷类化合物2个：分别为豆甾醇(19),胡萝卜苷(20)；生物碱1个为三乙醇胺(22)。其中(1)为新化合物；(22)为新天然产物；(8)和(21)为首次从五加科中分离得到的化合物；(7)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)为首次从无梗五加植物中分离得到的化合物。二、无梗五加化学成分的UPLC-MS/MS分析及其与细柱五加、剌五加的比较研究采用UPLC-MS/MS法,对无梗五加根、茎、叶和果实,以及五加属植物细柱五加和刺五加的根、茎、叶的化学成分进行定性分析和比较。通过与对照品色谱峰的保留时间以及一级、二级质谱图比对,从三种五加属植物中鉴定了25种化学成分,并推测了33种化学成分的结构。分别阐述了三种五加属植物中的奎宁酸类、木脂素类、黄酮类、香豆素类、酚苷类和三萜类化学成分的质谱解析过程。重点对木脂素类成分的质谱裂解规律进行了研究,为木脂素类成分的准确鉴别提供依据。本研究还对无梗五加与细柱五加、刺五加的化学成分进行比较,在三种五加属植物各部位中,普遍存在咖啡酰奎宁酸类成分和双四氢呋喃型木脂素糖苷类成分。无梗五加根与细柱五加根中的成分比较相似,刺五加根中含有在无梗五加根和细柱五加根中未检测到的多种酚苷类成分。三种五加属植物的茎中的成分与根相差不大,但在无梗五加和细柱五加茎中还检测到了不同数目和种类的三萜类成分。与根、茎相比,三种五加属植物叶中的黄酮和三萜成分数目增加、木脂素成分数目减少。本研究对进一步开发五加属药用新资源和扩大五加属产品种类具有一定的意义。三、无梗五加根指纹图谱研究建立了无梗五加根的UPLC-PDA指纹图谱,标定了18个共有峰,并通过与对照品对照以及一级、二级质谱信息分析指认了其中的13个共有峰。本研究尝试了将主成分分析法和系统聚类分析法两种模式识别方法相结合,对无梗五加根的UPLC-PDA指纹图谱进行了研究。两种模式识别方法对于不同来源的19批无梗五加根给出的分类结果基本一致,确保了分析结果的客观性和统一性。还比较了SPSS软件与Simca-P软件进行主成分分析的异同,为指纹图谱分析软件的使用提供了新的思路。采用毛细管气相色谱法建立了无梗五加根中挥发性成分的GC指纹图谱,并采用GC/MS法对无梗五加根挥发油成分进行分析,经过NIST谱库检索确认了29个共有挥发油成分。对19批无梗五加根测定后进行聚类分析,采用国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立共有模式并计算各个样品的相似度。本研究将无梗五加根UPLC-PDA指纹图谱与挥发油指纹图谱的系统聚类结果进行了比较,二者的给出的结果并不一致。说明在活性成分群不明确的情况下,应采取多种样品制备方法、多种检测方式相结合的手段使所建立的中药指纹图谱尽可能涵盖全部的化学信息。四、无梗五加七种有机酸成分的含量测定及其与细柱五加、刺五加的比较研究建立了同时测定绿原酸,新绿原酸,咖啡酸,1,3-二咖啡酰奎宁酸,异绿原酸B,异绿原酸A和异绿原酸C七种有机酸成分的HPLC-UV含量测定方法。色谱柱为HypersilODS2C18,流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈系统梯度洗脱。应用该方法测定了不同生长年份(4、5、6、7、8年生)的无梗五加根中七种有机酸成分的含量,结果表明有机酸成分种类及含量总和随无梗五加生长年份的增加而增加；测定了无梗五加的根皮、茎皮、根木质部、茎木质部中七种有机酸成分的含量,结果表明根与茎木质部中的有机酸含量均远远小于各自皮部中的有机酸含量；测定了无梗五加根、茎、叶、果中七种有机酸成分的含量,结果表明果中有机酸的含量与其他部位差异较大,主要成分为新绿原酸和异绿原酸A；测定了无梗五加、细柱五加、刺五加的根、茎、叶中七种有机酸成分的含量,结果表明三者根部有机酸成分的含量差异不大,茎部和叶部中的含量均有一定的差异。本文所建立的分析方法专属、准确,为更好的控制无梗五加药材质量以及与五加属的其他药材进行对比研究提供了方法。五、无梗五加根中四种木脂素类成分在大鼠体内药动学研究建立了同时测定大鼠血浆中细辛脂素、芝麻脂素、赛菊宁黄质和洒维宁的UPLC-MS/MS分析方法。采用液-液萃取法进行血浆样品预处理,色谱柱为ACQUITYUPLCTMBEHC18column(1.7μm,100mm×2.1mm,i.d.)；流动相为2mmol/L醋酸铵水-甲醇系统,等度洗脱；采用正离子检测方式,MRM扫描模式。方法线性良好,日内、日间精密度、准确度、基质效应、提取回收率和稳定性均符合生物样品测定要求。利用该方法对大鼠灌胃给予无梗五加根70%乙醇提取物后的药物动力学行为进行研究,为无梗五加根的临床应用给药方案的设计提供参考。各成分的药动学参数为：细辛脂素、芝麻脂素、赛菊宁黄质和洒维宁的Cmax分别为392.8±51.2ng/mL,1285.6±117.4ng/mL