SN 1005-2001出口肉品中富拉磷残留量检验方法 杯碟法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口肉品中富拉磷残留量检验方法杯碟法Methodforthedeterminationoffravophospholipolresidues2001-12-30发布l本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》及SN/T0005—1996《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素生物学检验方法标准编写的基本规定》的要求而编写的。其中测定方法是采用日本厚生省《畜水产食品中的残留物质检验方法》和美国AOAC《公定分析方法》中相应的分析方法。但在技术内容上稍有改变，经验证后按规定格式要求进行编写。在标准中同时制定了抽样和制样方法。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准首次发布。1出口肉品中富拉磷残留量检验方法杯碟法Methodforthedeterminationoffravophospholipolresiduesinmeatforexport—Cylinderplatemethod本标准规定了出口肉品中富拉磷残留量检验的抽样、制样和杯碟测定法。本标准适用于出口分割猪肉中富拉磷残留量检验，其他肉品可参照使用。2抽样和制样2.1检验批以不超过2500件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征。如包装、标记、产地规格和等级等。抽样数量152.3抽样方法按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于如每件中无小包装或有小包装但每袋质量超过2kg者，则可用灭菌刀具在抽出的包件中，每件取不少于100g,混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合后原始样的总量不少于2kg,加封后，标2.4试样制备将代表性样品中的可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g,作为试2.5试样保存将试样于—18℃以下冷冻保存。注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-12-30批准2002-06-01实施23.1方法提要用50%甲醇溶液抽提试样中的富拉磷，均质后，用氢氧化钠溶液调至pH8.0,回流煮沸15min,冷的大小用标准曲线法定量地测定富拉磷的含量。3.2试剂和材料3.2.1富拉磷标准品：904μg/mg,由日本农林水产省东京肥饲料检查所提供。3.2.4生理盐水：称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121℃高压灭菌15min。3.2.5缓冲液1(pH7.0):称取6.4g无水磷酸二氢钾，18.9g无水磷酸氢二钠溶于水中，定容至1000mL,121C高压灭菌15min。3.2.6试验菌种：蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus),由中国药品生物制品检定所提供，菌株号码14579。3.2.7富拉磷标准储备液：准确称取适量的富拉磷标准品，先用少量甲醇溶解，再加甲醇溶液[甲醇：水(体积分数)=1:1],配制成富拉磷浓度为1000μg/mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存，可使用一个月。3.2.8富拉磷标准工作液：取一定量富拉磷标准储备液，用缓冲液1(3.2.5)稀释成浓度为0.094,0.188,0.375,0.75,1.5μg/mL3.2.9培养基I:见附录A中A1。3.2.10培养基I:见附录A中A2。3.3仪器和设备3.3.3游标卡尺：测量范围0～150mm,精度0.02mm。3.3.4均质器：转速不低于10000r/min。3.3.5离心机：转速不低于4000r/min。3.3.6恒温培养箱：0～50C,搁板应保持水平。3.3.8恒温水浴锅。3.4测定步骤3.4.1样液的制备称取10.0g试样于均质杯内，加入90mL50%甲醇，10000r/min均质2min,转入蒸馏瓶中，用氢氧化钠溶液调至pH8.0,90℃回流煮沸15min,冷却后移入离心管中，以3000r/min离心20min,取上清液作为试验样液。3.4.2芽胞悬液的制备将试验菌种(3.2.6)接种于营养肉汤培养基试管内，经(28±1)C培养(18±1)h,取1mL菌液，加入盛有适量培养基I的克氏瓶中，涂抹均匀。置培养箱(28±1)C培养一周。镜检芽胞数达85%以上，用适量灭菌生理盐水洗下菌台，于65C恒温水浴中加热30min,再以3000r/min离心10min,弃去上清液，如此重复洗涤2～3次，再于65C水浴中加热30min,最终用适量灭菌生理盐水稀释，制成芽胞悬3液，置4℃冰箱可保存数月。3.4.3芽胞悬液用量的确定在实际测定前把不同量的芽胞悬液加到培养基Ⅱ中，制成平板，培养(18±1)h,测定能使0.094μg/mL标准工作液产生直径≥10mm,清晰、完整的抑菌圈的最佳芽胞悬液用量。3.4.4检定用平板的制备将培养基I熔化后，冷却至45C～50℃,加入适量芽胞悬液(从3.4.3测得),混匀，取8mL注入培养皿，使培养基均匀覆盖其底面，保持水平，待其凝固。所用平板须当天制备。3.4.5标准曲线的制备用富拉磷标准工作液(3.2.8)制备标准曲线，以0.375pg/mL浓度的标准工作液为参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板为一组，每个平板上置6个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60°角间距，其中3个间隔位的牛津杯中加0.375μg/mL参考浓度标准工作液，另3个间隔位的牛津杯加其他浓度的一种标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于制备标准曲线0.375μg/mL参考浓度的标准工作液将得到36个数值，而其他标准工作液分别得到9个数值。将陶瓦盖盖好，置(28±1)C培养(18±1)h。培养后，取出平板，除去牛津杯，精确测量各个浓度的抑菌圈直径(精确到0.1mm),分别求出每组3个平板上参考浓度的抑菌圈直径读数和其他浓度的抑菌圈直径读数的平均值。再求出0.375pg/mL参考浓度36个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为每组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H点的直径，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级),富拉磷标准工作液浓度(μg/mL)为横坐标(对数级),通过L和H点连一直线即为标准曲线。L=(3a+2b+c-e)/5 (1)H=(3e+2d+c-a)/5 (2)式中：L——标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，mm;H——标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径，mm;c——参考浓度0.375μg/mL的36个抑菌圈直径的平均值，mm;a,b,d,e——分别表示标准曲线中其他标准浓度(0.094,0.188,0.75,1.5μg/mL)的抑菌圈直径经校正3.4.6样液的测定每份样液取3个检定平板，在每个平板上放6个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置),在相间隔3只牛津杯里注满试验样液，在剩余的3只牛津杯里分别注满富拉磷标准参考浓度工作液(0.375μg/mL)。将陶瓦盖盖好，于(28±1)℃下培养(18±1)h,然后取出平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，准确测量抑菌圈直径(精确到0.1mm)。3.5结果的计算和表述如样液抑菌圈直径<10mm,如样液抑菌圈直径≥10mm,求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的富拉磷浓度，通过式(3),计算试样中富拉磷残留量：X=c/m (3)c——从标准曲线上查出的样液中富拉磷浓度，pg/mL;m——每毫升最终样液所代表的试样量，g。44测定低限和回收率4.1测定低限本方法的测定低限为0.94mg/kg。4.2回收率富拉磷添加浓度在0.94pg/g时，回收率为93.9%;富拉磷添加浓度在3.75μg/g时，回收率为83.2%;富拉磷添加浓度在7.5μg/g时，回收率为92.8%。5(标准的附录)A1培养基I(保存及增菌用培养基)牛肉浸膏5.0g琼脂15g蒸馏水1000mL将上述各成分于蒸馏水中加热溶解，调节pH,使其灭菌后pH为6.5±0.1,分装于克氏瓶中，于121℃高压灭菌15min。A2培养基I(基层及菌种用培养基)蛋白胨3.75g氯化钠1.25g酵母膏1.25g琼脂15g将上述各成分于蒸馏水中加热溶解，调节pH,使其灭菌后pH为7.3±0.1,分装于锥形瓶中，于121℃高温灭菌15min。6ThisstandardwasdraftedinaccordancewiththerequirementsoftheGB/T1.1—1993"Direc-tivesfortheworkofstandardization—Unit1:Draftingandpresentationofstandards—Part1:Gen-eralrulesfordraftingstandards"andSN/T0005—1996“Generalrulesfordraftingthestandardofbiologicalmethodforthedeterminationofpesticide,veterinarydrugresiduesandbiotoxinsincommoditiesforexport."Inthisstandard,therelevantmethodforthedeterminationofresiduesinanimalandaquaticproductsofHealthMinistryofJapanandtheofficalmethodofAOAC(U.S.A)areadoptedasthemethodofdetermination,whichistechnicallyequivalenttothoseoftheorigi-nal,butwithslightmodification.Aftergoingthroughverification,thisstandardwasdraftedaccord-ingtotheeditorialrequirementsforthestipulatedformat.Inaddition,themethodsofsamplingandsamplepreparationarealsospecifiedinthisstandard.AnnexAisthestandardannex.ThisstandardwasproposedbyandisunderthechargeofChinaNationalRegulatoryCom-missionforCertificationandAccreditation.ThisstandardwasdraftedbytheHubeiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauoftheThisstandardwasmainlydraftedbyZhaoHui,HuangYang,ZhangZongxian,XuXinsheng.Thisstandardispromulgatedforthefirsttime.7ProfessionalStandardMethodforthedeterminationofSN/T1005—2001ThisstandardspecifiesthemefravophospholipolresiduesbycyliThecharacteristicsofthecargowithinthesameQuantityofsampl26～1005intime.ApprovedbyGeneralAdministratSupervision,InspectionandQuarantineofthe8Incasetherearenotsmallbagsinsideeachpackage,oriftherearesm2.4PreparationoftesNote:Inthecourseofsamplingandsamplepreparation,precautionmustbetakentoavoidcontaminationoranyThefravophospholipolresiduesinthetestsampleareextractedwith50%methawhichfravophospholipolisdeterminedquantitativelybystandardcurvemethod.Unlessotherwisespecified,allreagentsshouldbeanalyticallypure,“water”isdistilled3.2.1Fravophospholipolstandard:904pg/mg,Providedbythestituteunderprovinceofagricultureforestandaquaticproducts,Tokyo,Japan.3.2.3Sodiumhydroxide:40%(m/m).3.2.4Physiologicalsaline:Dissolve8.5gofsodiumchloridein1000mLofwater,autoclaveat3.2.6Teststrain:Bacilluscereus,No.14579,providedbytheDrugandBiologi93.2.7Fravophospholipolstandardstocksolution:Accuratelyweighaproperamountfravophospholipolstandard,dissolvewithalittlemethanolanddilutewithmethanolsolution(methanol:distilledwater=1:1,V/V)toprepareafravophospholippolstandardstocksolutionof3.2.8Fravophospholipolstandardworkingsolution:FurtherdilutetheFravophospholipolstan-dardstocksolutionwithbuffersolutionI(3.2.5)toobtainaseriesofof0.094,0.188,0.375,0.75,1.5μg/mLinconcentrations,whichshouldbepreparedandusedonthesameday.3.3Apparatusandequipment3.3.1Culturedishes:90mm(id)glassorplastic3.3.2Cylinder:Stainlesssteel,(8.0±0.1)mm(od),(6.0±0.1)mm(id),(10.0±0.1)mmheight.3.3.3Verniercaliper:measuringrange:0~150mm,precision:0.02mm.3.3.4Homogenizer:Speed≥10000r/min.3.3.5Centrifuge:Speed≥4000r/min.3.3.6Incubator:0~50℃,itsshelfkepthorizontal.3.3.8Water-bath.3.3.10Others:Refluxcondenser,Stillflask,Rouxbottle,Centrifugaltubesetc.Weigh10.0gofsampleinasterilizedhomogenizingcup,and90mL50%methanol,homogenizeat3000r/minfor20min.Thesupernatantisusedfortestsamplesolution.mediumI.Spreadthecultureevenlyovertheentiresurface.Incubateat(28±1)℃foroneweesporesuspensionwithing.Preparethestandardcurvewithfravophospholipolstandardworkingsolution(3.2.8),usethefravophospholipolstandardworconcentrationsolution.Takethreeplat2.8cmradius.Fill3cylinderswithrefercylinderswithoneofotherconcentrationofstandardworkitions.theplatesout,removethecylinders.Measurethediameterofeachzoneofinhibition(accuratetoconcentrationfrom12platainedforeachconcentrationtothevalueitwouldbeiftheaverageofthereferenceconcentrationreadingforthatsetof3plateswasthesameasthecorrectionpoint.Bythesecorrectedvalues,cal-culatethevaluesofpointLandpointHbytheequation(1)and(2),andplotthepointLandpointHonthesemiloggraphpaper,usinglogarithmicscaleasabscissaforconcentrations(μg/mL)andarithmeticscaleasordinateforaveragezonediameters(mm).ConstructastraightlinethoughpointLandpointHasthestandardcurve.L=(3a+2b+c-e)/5 (1)H=(3e+2d+c-a)/5 (2)whereL—thezonediameterofthelowestpointofthestandardcurve,mm;H—thezonediameterofthehighestpointofthestandardcurve,mm;c—averageofall36readingsofreferenceconcentration(0.375μg/mL),mm;a,b,d,e—correctedaveragezonediametersforeachconcentration(0.094,0.188,0.75,1.5μg/mL)forthestandardcurve,mm.3.4.6DeterminationofsamplesolutionUsethreeplatesforeachtestsample,placesixsterilizedcylindersoneachplaterespectivelyattheplacesasforstandardcurvepreparation.Filltheintervalthreecylinderswithsamplesolution,andotherthreecylinderswith0.375rg/mLreferenceconcentrationsolution.Placetheclaycoversontheplatesandincubateat(28±1)℃for(18±1)h.Taketheplatesout,removethecylinders,mea-surediametersofinhibitionzoneasaccuratelyaspossible.3.5CalculationandexpressionoftheresultsIfthevalueoftheinhibitionzoneislessthan10mm,reportresiduesoffravophospholipolinsam-pl