第四章 紫外-可见分光光度法教材

第四章紫外-可见

分光光度法

波粒二象性回顾光的性质M+热M+荧光或磷光M————M*基态激发态E0

E1不同的物质，具有不同的原子或分子结构，其跃迁需要的能级差

E不同，即吸收不同波长的光。E2E1E0基态激发态

Eλ=hc/E吸收光谱发射光谱吸收光三月244光谱区间

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-3nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光400～760nm0.1nm～10nm~750nm~0.1cm0.1cm～100cm1m～1000m200~400nm远紫外近紫外（真空紫外）4

在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:

紫外吸收光谱：吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。

可见吸收光谱：吸收光波长范围400760nm，主要用于有色物质的定量分析。

红外吸收光谱：吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。第四章紫外-可见分光光度法第一节基本原理

UV-vis是根据物质分子对紫外-可见光区（200~760nm）范围的电磁辐射的选择性吸收特性而建立的一种定性和定量方法。属于分子吸收光谱。1.透光率(透射比,T)透光率:透过的光强度与入射的光强度之比T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透过T=100.0%一、透光率和吸光度

2.吸光度(A)（也称光密度D或消光度E）T=100.0%A=0.0

C↑→T↓→A↑3.透光率T和吸光度A的关系A与T的互换:A=-lgT；T=10-A练习1:T=75%,求A=?

A=-lgT=-lg0.75=0.125练习2:A=0.36,求T=?

T=10-A=10-0.36=0.436=43.6%

二、朗伯-比尔定律（一）光的吸收定律——定量分析的依据

当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及溶液层的厚度l的乘积成正比关系。称为朗伯-比尔定律：朗伯—比耳定律数学表达式：

式中：A，吸光度，无量刚；

l，液层厚度(光程长度)，cm；

c，溶液的浓度；

k,称为吸光系数，仅与入射光波长和强度、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。

影响吸光系数的因素及意义影响吸光系数的因素物质的性质溶剂入射光波长、强度温度意义吸光系数越大，灵敏度越高

（一）光的吸收定律

吸光度具有加和性，即如果溶液中同时存在多种吸光物质，那么，测得的吸光度则是各吸光物质吸光度的总和。其表达式为：

A=A1+A2+A3+……

二、朗伯-比尔定律

（二）偏离朗伯-比尔定律的因素

根据朗伯-比尔定律,如固定液层厚度l，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。

二、朗伯-比尔定律1.非单色光的影响

在紫外-可见分光光度计中，由于仪器性能的限制，得到的不是严格的单色光，A偏小，产生负偏差。

2.非均相体系的影响

样品为不均匀的体系，光线会出现反射、散射，It偏小，A偏大，产生正偏差。（二）偏离朗伯-比尔定律的因素

3.溶液本身发生化学变化的影响

溶液中待测组分发生了解离、缔合、光化等作用。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡：

（二）偏离朗伯-比尔定律的因素4.浓度的限制

朗伯-比尔定律假定吸光质点之间不发生相互作用，因此只有在稀溶液时才基本符合。

一般要求0.2＜A＜0.8

最佳要求0.3＜A＜0.7

（二）偏离朗伯-比尔定律的因素

三、吸光系数

摩尔吸光系数ε

百分吸光系数

吸光系数k

物理意义是指样品浓度为1mol/L的溶液置于1cm样品池中，在一定波长下测得的吸光度值。量纲为L/（mol·cm）

。ε104102中强吸收弱吸收强吸收（一）摩尔吸光系数εA=εlc（二）百分吸光系数又称比吸光系数，物理意义是指溶液浓度在1%（1g/100mL），液层厚度为1cm时，在一定波长下的吸光度值。量纲为100mL/（g·cm）(一般不写单位）

ε与的关系？

例4-1用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波长为278nm处测得其透光率为24.3%，试计算氯霉素在278nm波长处的摩尔吸光系数和比吸光系数。

解：已知M=323.15g/mol；c=2.00×10-3(g/100ml

)

T=24.3%;A=-lgT=-lg0.243=0.614练习1用双硫腙法测定Cd2+溶液的吸光度。当溶液的浓度为140μg/L，在最大吸收波长520nm处测得吸光度为0.44，吸收池厚度为2cm，求比吸光系数和摩尔吸光系数。(已知镉的M=112.4g/mol)解：已知c=140ug/L=1.4×10-5g/100mlA=0.44;l=2cm练习2：有一浓度为1.0g/mlFe2+的溶液，与邻二氮菲显色后，在比色皿厚度为2cm、波长510nm处测得吸光度为0.380，计算(1)透光率；(2)摩尔吸光系数。（1）T＝10-A＝10-0.380＝0.417=41.7%（2）解：已知c=1.0g/ml=1.0×10-3g/L

=

四、吸收光谱（吸收曲线）在溶液浓度和液层厚度一定的条件下，测定溶液在不同波长处的吸光度，以为横坐标，A为纵坐标作图,即可得一条曲线称为吸收光谱（A~

曲线）。

max=510nm吸光度最大时，对应的波长为最大吸收波长（λmax）邻二氮菲亚铁溶液如何绘制吸收光谱？λ/nmA4400.1874500.2354600.3684700.454800.6394900.7295100.7855300.5915600.364

四、吸收光谱（1）同一物质，对不同波长的吸光度不同；一般选择λmax为测定波长。

吸收曲线是选择入射光波长（λmax）的重要依据。（2）同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似，λmax不变，且在同一波长处吸光度随浓度降低而减小。

A=kcl作为定量分析的依据

（3）不同物质，吸收曲线特性不同。吸收曲线是作为物质定性分析的依据A.生色团一些常用名词是指分子中产生吸收带的主要官能团（通常含有π键）；生色团为不饱和基团：C=C、N=O、C=O、C=S等；B.助色团是指分子中能增强生色团的吸光能力，并使生色团的吸收带向长波移动。助色团为含有未共用电子对的杂原子基团：-OH、-X(卤素）、-OR、-SH、-NH2C.红移是指化合物的吸收峰向长波移动，这种效应称为红移。D.蓝移是指化合物的吸收峰向短波移动，这种效应称为蓝移。E.增色效应：使吸光度增强F.减色效应：使吸光度减弱§4.2紫外-可见分光光度计

一、主要部件（五个部件）光源单色器吸收池显示器检测器1．光源：提供入射光钨灯或卤钨灯——可见光源氢灯或氘灯——紫外光源

氙灯氢灯钨灯2．单色器：

其作用是将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出任一波长单色光的光学系统。包括狭缝、色散元件和透镜系统。

色散元件：是将复合光分解成单色光，有棱镜或光栅两种。光栅示意图3.吸收池

玻璃比色皿——仅适用于可见光区石英比色皿——用于紫外和可见光区

一、基本构造

要求1.比色皿应配套使用（△T≤0.3%)；2.在使用和清洗过程中,严禁用手指触摸透光面，严禁用硬质纤维擦透光面,只能用擦镜纸擦拭透光面；3.使用前应先洗净并用待装液润洗三次；4.盛装溶液时，高度为比色皿高度的2/3~4/5处，不能装满；5.使用完立即用清水洗净，倒扣。

4.检测器

检测透射光的强度，并把光信号转变为电信号的装置例如：灵敏度较高的光电倍增管等；

5.信号处理系统记录信号并进行处理的装置例如：连接在仪器上的微型计算机

紫外-可见分光光度计模式设定显示窗拉杆样品室0%T100%T波长设定参比挡光板待测分光光度计的使用方法1.开机，预热20分钟2.设波长3.配对比色皿：

1).按“模式键”，选择“T”；

2).将参比溶液分别倒入2个比色皿中，放入样品室；

3).将挡光板或黑体拉入光路中，按0%T键；

4).将第1个比色皿拉入光路中，按100%T键，再将第2个比色皿拉入光路中读出透光率；

5).两个比色皿透光率之差应≤0.5%4.调零（A=0)：按“模式键”，选择“A”。将第1个装有参比溶液的比色皿拉入光路中，按100%T键5.测定：将第2个比色皿中的参比溶液弃去，倒入待测溶液并拉入光路中，稳定后读数。注意：改变波长，必须重新调零倒溶液时远离仪器，避免溅湿仪器紫外分光光度计与可见分光光度计的差异思考？名称可见分光光度计紫外分光光度计波长范围光源吸收池材料名称可见分光光度法紫外分光光度法波长范围可见光(400～760nm)紫外光(200～400nm)光源钨灯卤钨灯氙灯氢灯氘灯吸收池材料玻璃石英石英紫外分光光度法与可见分光光度法的差异二、常见紫外-可见分光光度计类型③双波长分光光度计①单波长单光束分光光度计②单波长双光束分光光度计光度计类型

1.单波长单光束分光光度计

由一束单色光依次通过样品池和参比池二、常见紫外-可见分光光度计类型

2.单波长双光束分光光度计

一束光分为强度相等的两束，分别通过样品池和参比池二、常见紫外-可见分光光度计类型

3.双波长分光光度计

用两不同波长的单色光交替通过吸收池，得到不同波长处吸光度的差值进行测定,无需参比池。二、常见紫外-可见分光光度计类型§4.3分析条件的选择分析条件的选择测量波长狭缝宽度吸光度的范围仪器条件的选择显色剂反应的要求显色条件的选择溶剂参比溶液试剂参比溶液样品参比溶液平行操作参比溶液参比溶液显色条件选择

一、仪器条件的选择（一）测量波长

一般选

max为入射光波长（测量波长）。如果

max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。

（二）狭缝宽度

狭缝宽度变宽单色性减弱变窄光线强度减弱灵敏度↓↓通常选在不减少吸光度时的最大狭缝宽度为适宜的狭缝宽！

一、仪器条件的选择灵敏度（三）吸光度的范围

当吸光度A在0.3～0.7范围内时，实验的测量误差较小。通常实验时，将吸光度的测量范围控制在0.2～0.8内。

一、仪器条件的选择

二、显色条件的选择显色反应——使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的反应。显色剂——与待测组分反应形成有色化合物的试剂。

橙红色，max=510nm邻二氮菲（一）显色剂反应的要求1.显色反应灵敏度高

显色反应产物的ε愈大，灵敏度愈高；2.显色剂选择性高

显色剂应尽量只与待测组分反应，而不与溶液中其他共存组分反应。

二、显色条件的选择（一）显色剂反应的要求

3.显色剂的对照性要高

显色剂与生成物的λmax差别在60nm以上

4.显色产物稳定

显色反应产物应有一定的稳定性。

二、显色条件的选择（二）显色条件的选择

1.显色剂浓度及用量

选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）的显色剂用量。

二、显色条件的选择（二）显色条件的选择

2.溶液pH

选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）所对应的pH范围。

3.显色反应的时间和温度

二、显色条件的选择

显色温度通常选在室温下进行，有的显色反应发生较慢，可适当升高温度。灵芝多糖溶液加入显色剂后的时间-吸光度曲线

三、参比溶液

测量待测溶液的吸光度时，先用参比液调节T=100%(A=0)为什么需要使用参比溶液？使测得的吸光度真正反映待测溶液吸光度。A=A1+A2+…+A(x)，A1+A2+…=0,A=A(x)。

1.溶剂参比溶液

当样品简单，无显色剂或显色剂无吸收，直接用溶剂作参比溶液。

2.试剂参比溶液对于显色反应，显色剂如有吸收，可在溶剂中加入与样品溶液相同含量的显色剂的溶液作参比溶液。

三、参比溶液

3.样品参比溶液对于样品较为复杂的显色反应，可用不加显色剂的样品溶液为参比溶液。

4.平行操作参比溶液

若显色剂、样品溶液中各组分均在设定波长下有吸收，则可采用显色剂与除待测组分外的其他共存组分混合作为参比溶液。

三、参比溶液§4.4紫外-可见分光光度法的应用定性分析定量分析应用光谱对照特征数据比较吸光度比值的比较单一组分的测定多组分的测定

一、定性分析

1.光谱对照同样条件下测定待测物和标准物的吸收光谱，如果两者吸收光谱一样，可认为是同一物质。如无标准物，也可比较标准谱图集里的光谱。

2.特征数据比较

λmax和是用于定性鉴别的主要光谱数据

3.吸光度比值的比较

有些物质的光谱上有几个吸收峰，可在不同的吸收峰（谷）处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。

一、定性分析

二、定量分析

定量分析的依据是

1.单一组分的测定（1）吸光系数法（绝对法）查得吸光系数后,根据吸光度求得样品浓度.

例4-2已知维生素B12在361nm处的百分吸光系数为207。精密称取样品45.0mg，加水溶解后稀释至1000mL，在该波长处用1.00cm吸收池测定溶液的吸光度为0.736，计算样品溶液中维生素B12的质量分数。解：已知A=0.736=207l=1.00cm由A=klc样品中维生素B12含量为

1.单一组分的测定（2）标准对比法（对照法）配制待测溶液X和标准溶液S，并在相同条件下分别测定吸光度。根据朗伯-比尔定律，

二、定量分析缺点：只有在测定的浓度区间内溶液完全遵守朗伯-比尔定律，并且Cs和Cx很接近时，才能得到较为准确的结果。例4-3为测定维生素B12原料药含量，准确称取试样25.0mg，用蒸馏水溶解后，定量转移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度后，摇匀。另称取同样质量的B12标准品，用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml，摇匀。在361nm波长处，用1cm比色皿分别测得样品溶液和标准品溶液的吸光度分别为0.603和0.718。求试样中B12的百分含量。解：已知Ax

=0.603As

=0.718两溶液配制、稀释方法一致

二、定量分析练习：用相同方法配制苯甲酸标准溶液（此溶液1ml含8μg苯甲酸）和样品溶液，在相同条件下分别测定吸光度。苯甲酸标准溶液的吸光度为0.630，样品溶液的吸光度为0.498。求样品溶液中苯甲酸的浓度？

1.单一组分的测定（3）标准曲线法——最常用三磺基水杨酸合铁配合物波长420nm其方法和步骤是：1）配制一组浓度不同的标准溶液(c1、c2……)；2）在λmax处，分别测定吸光度(A1、A2……)。3）以A为纵坐标，c为横坐标，绘制曲线，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（A-c曲线）。4）测定待测溶液的吸光度Ax，Ax

cx。

二、定量分析如何制作标准曲线？c(mol/L)A0.010.2030.020.4100.030.6210.040.817

2.多组分的测定

（1）吸收光谱互不重叠（2）吸收光谱部分重叠（3）吸收光谱相互重叠

二、定量分析

2.多组分的测定（1）吸收光谱互不重叠此种情况下可以按单组分测定的方法分别求得各个组分浓度

二、定量分析2.多组分的测定（2）吸收光谱部分重叠例如右图，可先在无干扰处λ2求得a的浓度，再求得b的浓度

依次求得a和b的浓度λ2处：λ1处：

二、定量分析

2.多组分的测定（3）吸收光谱相互重叠解方程组法,如右图λ1处：λ2处：12解方程组可得：

二、定量分析2.多组分的测定（3）吸收光谱相互重叠

等吸收双波长消去法例如右图，选取两个波长，a物质在这两波长处的吸光度相同λ1处：λ2处：

二、定量分析2.多组分的测定

λ1处：λ2处：两式相减，得：

在这两个波长处两组分总的吸光度的差值(⊿A)只和其中一个组分的浓度有关，可以依次求出各组分浓度。

二、定量分析本章小结理解紫外-可见分光光度法的基本原理；熟悉分光光度计的基本构造；重点掌握朗伯-比尔定律及其应用；作业P39计算题1、2P40简答题1、3课后练习1.某物质的吸光系数与下列哪个因素有关（

）

A.

溶液浓度

B.

测定波长

C.

仪器型号

D.

吸收池厚度2.用标准曲线法测定某药物含量时，用参比溶液调节A=0或T=100%，其目的是()A.使测量中c-T成线性关系B.使标准曲线通过坐标原点C.使测量符合比耳定律，不发生偏离D.使所测吸光度A值真正反映待测物的A值3.Lambert-Beer定律的表达式为()：A．A=

MB．A=

lcC．A=

lMD．以上均不对4.当透光率T=100％时，吸光度A为()：

A．0.100B．∞C．0D．以上