表面等离子共振技术样本

刘闯、魏巍、乔艳、苏瑞锐

摘要：SPR技术作为检测，分析生物分子互相作用有效工具，有些国家已经生产出成熟商业化SPR传感系统。对SPR生物传感器工作原理，应用领域，最新进展作出阐述，并对其在生物分子检测领域应用和研究发展前景进行了讨论。

引言：表面等离子共振技术（surfaceplasmonresonancetechnology，SPR）是20世纪90年代发展起来一种生物分子检测技术，是基于SPR检测生物传感芯片（biosensorchip）上配位体与分析物作用一种前沿技术，在20世纪初，Wood观测到持续光谱偏振光照射金属光栅时浮现了反常衍射现象，并且对这种现象进行了公开描述。1941年，Fano用金属与空气界面表面电磁波激发模型对这一现象给出理解释。1957年，Ritchie发现，当电子穿过金属薄片时存在数量消失峰。她将这种消失峰称之为“能量减少”等离子模式，并指出了这种模式和薄膜边界关系，第一次提出了用于描述金属内部电子密度纵向波动“金属等离子体”概念。2年后，Powell和Swan用实验证明了Ritche理论。随后，Stem和Farrell给出了这种等离子体模式共振条件，并将其称为“表面等离子共振技术（surfaceplasmonresonance，SPR）”。1968年，Otto和Kretschmann等人研究了金属和介质界面用光学方式激发SPR问题。并分别设计了两种棱镜耦合方式。此后，SPR技术获得了长足发展。1990年，国际上第一台商业生产生物传感器在瑞典Biocore公司诞生。实践证明，SPR传感器与老式检测手段比较，具备无需对样品进行标记，实时监测，敏捷度高等突出长处。因此，在医学诊断，生物监测，生物技术，药物研制和食品安全检测等领域有辽阔应用前景。

基本原理

1消失波，在波动光学没有发展起来此前，菲涅尔定理较好地描述了光在介质表面行走途径。（n1sinθ1=n2sinθ2），可以看出，当光从光密介质入射到光疏介质时（n1>n2）就会有全反射现象产生。但以波动光学角度来重新研究全反射时候就会发现，全反射光波会透过光疏介质约为光波波长一种深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。光总能量没有发生变化。透入光疏介质光波成为消失波。

图2消失波在界面传播2表面等离子波；等离子体普通是指由密度相称高自由正、负电荷构成气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，内部不形成空间电荷。如果把金属价电子当作是均匀正电荷背景下运动电子气体，这事实上也是一种等离子体。当金属受到电磁干扰时，金属中电子密度分布就会变得不均匀。设想在某一区域电子密度低于平均密度，那么就会形成局部正电荷过剩。这时由于库仑引力作用，会把近邻电子吸引到该区域，而被吸引电子由于获得附加动量，又会使该区域汇集过多负电荷,然而，由于电子间排斥作用，使电子再度离开该区域，从而形成价电子相对于正电荷背景起伏振荡。由于库仑力长程作用，这种局部电子密度振荡将形成整个电子系统纵向集体振荡，并以密度起伏波形式来体现。可知，金属中价电子相称于正离子背景这种振荡与导电气体中档离子振荡相似，故称为金属中等离子振荡。表面等离子振荡也是如此，咱们可以当作其内部也有一定电子振荡波存在。3当光线在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会在金属膜中产生消失波，消失波与表面等离子波发生共振时，检测到反射光强会大幅度地削弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光大某些能量被表面等离子波吸取，使得反射光能量急剧减少。因而，可以反射光强响应曲线看到一种最小尖峰，此时相应入射光波长为共振波长，相应入射角为共振角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率变化又与金表面结合分子质量成正比。这就是SPR对物质结合检测基本原理。SPR传感系统普通是由光学系统，老式系统和检测系统这3某些构成。其中，光学系统涉及光源和光路，用以产生合乎性能规定入射光；传感系统运用上述原理将待测信息转换为敏感膜折射率变化，并通过光学耦合转换为共振角或共振波长变化；检测系统检测反射光发光强度，记录共振吸取峰位置，当入射波以某一角度或某一波长入射，近场波矢K和SPW波矢相等，发生谐振，入射光能量耦合到SPW波，反射光强度浮现一种凹陷。此时入射光角度称为SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率变化又与金表面结合分子质量成正比

图3SPR检测原理当入射波以某一角度或某一波长入射，近场波矢K和SPW波矢相等，发生谐振，入射光能量耦合到SPW波，反射光强度浮现一种凹陷。此时入射光角度称为SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率变化又与金表面结合分子质量成正比.(生物秀实验频道

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仪器工作原理：

以瑞典Biacore3000型SPR仪为例，简介这种仪器工作原理。Biacore3000由工作单元和一台安装有BiacoreControl软件电脑构成。工作单元又分为液体解决单元和光学系统。

Biacore3000工作单元由如下6某些构成

两个液体传送泵：其中一种泵负责保持稳定流速液体流过传感芯片表面，另一种泵负责自动自动进样装置中样品传送自动上样装置(autosampler)：负责样品混合、注射和回收。

一体化U型射流器（Integratedu-FluidicCartridge，IFC）：包括液体传送通道，样品环和阀门。

检测单元：涉及可以产生和测量SPR信号光电组分。

四个可探测液体池(flowcell)：该液体池通过将IFC靠在传感芯片上而形成。

微解决装置(microprocessors)：它能控制泵，自动上样装置，和IFC阀门并且能对SPR信号作基本解决。

传感芯片插入检测单元芯片盒中，引入（dock）仪器后于IFC共同形成液体池。IFC通过连接块与缓冲液相连。连接块上有注射口，通过注射口可以将样品加载到IFC上。

温度控制

SPR信号对于温度变化非常敏感，因此在整个实验过程中保持传感芯片表面温度恒定是非常重要Biacore3000采用Peltier元件来控制传感芯片表面温度。会不断闪烁。如果温度不稳定，仪器前部面板上黄色LED（light-emittingdiode通过预先设定，咱们可以把温度控制在4-40ºC之间任意一点（不能比环境温度低20度）(生物秀实验频道

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LED状态批示器

仪器前部面板上有5个LED状态批示器：

Ready(green):灯亮表达电源打开，仪器准备就绪。

Error（red）：灯亮表达仪器浮现问题，当电源打开时，此灯亮几秒钟，如果在其她状况下亮起都阐明仪器浮现了严重问题。

Temperature（yellow）：灯光稳定代表温度稳定，灯光闪烁阐明温度不稳定。

Sensorchip（green）：灯光稳定代表传感芯片安装到位，灯光闪烁表白未安装传感芯片或安装不到位，浮现错误。

Run（green）：仪器在工作时此批示灯亮起。SPR仪传感芯片

应用于SPR仪传感芯片（sensorchip）有两个基本特性：一方面是传感芯片玻璃表面覆盖有薄薄金层，这是产生SPR信号所必须条件，是探测生物分子间互相作用基本；此外一种特性是，在金层上面又有一种覆层，这种覆层不影响SPR效应，可以连接配体并为所要研究分子互相作用提供适当环境。为以便起见普通咱们把连接在传感芯片上分子称为配体（ligand），把代测分子称为分析物（analyte）。

传感芯片表面金层和其上覆层是很稳定，它可以耐受极端PH和许多中档浓度有机试剂。一旦配体被固定在传感芯片上之后，传感芯片对于各种试剂和条件耐受限度就重要取决于所连配体性质。传感芯片自身镶嵌在塑料载体上，并有一种塑料鞘，以以便使用。

图7传感芯片示意图SPR是入射光衰势波与介质表面等离子波形成共振，只要能到达到共振就能有spr现象产生，因此依照SPR有4种分析办法

1角度调制法：固定入射光波长，变化入射角度，观测到反射光归一化强度

2波长调制法：固定入射光角度，变化入射光波长，观测入射光归一化强度

3强度调制法：如射光角度和波长都固定，凭借强度变化测量折射率变化

4相位调制法：入射光角度和波长都固定，观测反射光和入射光相差。

美国热电公司分子光谱部以其傅立叶变换红外技术经验结合最新SPR技术推出了崭新FT-SPR检测模块-SPR100，与角度扫描型SPR检测技术不同，SPR-100特性是在SPR检测体系中固定入射光角度，当在某一特定波长发生等离子共振现象时，入射p-偏振光能量几乎被完全吸取，从而检测到金属表面分子间互相作用。光纤藕合构造SPR传感器采用光纤作为光传播媒质.由于光纤特殊性,这种传感器具备其她构造所没有特点:它可以很以便地探测某些人类难以进入或者有害地方,可以通过光线对敏感信号传播,实现远程检测和分布式检测,并且也可以达到较高敏捷度.光纤藕合传感器一般是将普通光纤某些保护层剥离,将纤芯裸露出来,再在纤芯外包裹金属膜层及敏感层,检测时,将该某些与样液接触。从而实现以便敏捷检测。

SPR检测系统和检测仪器重要作用于生物特异互相作用分析，与老式互相作用技术如超速离心，荧光法，热量测定法等相比，具备检测过程以便快捷，敏捷度高；无需标记样品，保持了分子活性；样品需要很少；大多数状况下,不需要对样品进行解决；高通量，高质量分析数据；能在混浊甚至不透明样品中进行等特点，所以在检测领域有着更加辽阔应用。

Karlsoon等应用SPR检测系统自动生物特异互相作用分析进行了单克隆抗体－抗原互相作用动力学研究，Mackenzie等用生物特异互相作用分析进行了细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性定量分析。

SPR生物传感器应用

自Liedberg等于1983年初次运用SPR技术进行抗原抗体互相作用分析以来，SPR生物传感器技术已被广泛应用于蛋白质组学，细胞信号传导，受体/配体，抗体/抗原分子垂钓，免疫辨认，癌症研究和新药筛选等生命科学领域，用于实时和动态研究蛋白质-蛋白质，蛋白质-核酸，新药分子-靶蛋白等生物分子互作过程。特别是1990年，商业化SPR应用以来，SPR生物传感器从主线上变化了生物分子辨认科学，成为生命科学和制药研究上原则工具。此外在食品，环境科学，临床诊断，基因测序，疾病治疗，案件侦破，兴奋剂检测等应用领域不断扩展。（1）在检测方面，重要应用于物理量检测，化学检测和生物检测。物理量检测上，重要运用SPR传感器技术进行检测湿度传感系统及基于氢化无定型硅热光效应温度系统。化学检测上，重要运用SPR传感器通过检测共振角或共振波长变化来检测待测分子成分，浓度及参加化学反映特性。生物检测上，重要用于检测生物分子结合伙用或者通过生物分子结合伙用检测来完毕特定生物分子辨认及其浓度测定，例如初期抗原-抗体互相作用，streptatividin和维生素H互相作用及某些IgG检测。近年来，还涉及到蛋白质之间或者蛋白质与DNA互相作用检测以及蛋白质构造变化检测，抗肿瘤蛋白APC生物化学属性检测，酶蛋白与单克隆抗体动态反映过程检测，尚有细胞色数C，葡萄糖，机球素，铁蛋白，香烟中烟碱，破伤风毒素，艾滋病检测等。近年来，还浮现了运用SPR检测办法来监测酶促反映动态过程。（2）药物筛选。SPR技术因其实时，高通量，特异性及能在天然状态下研究药物分子与靶点互相作用，为新药研发提供了有力工具。在药物筛选，药物分子靶点鉴定及先导药物化合物构造优化方面有着广泛应用。当前发展中药物筛选生物传感器测试涉及两方面内容，一是从文库中筛选与靶蛋白结合化合物；二是进行普通ADME实验。（3）蛋白质组学。SPR技术因其高效敏捷无需额外标记等优势，广泛应用与蛋白质检测和蛋白-蛋白互相作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态状况下实时提供靶蛋白细胞器分布，结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新模式。（4）临床诊断。运用生物传感器鉴定和评价潜在疫苗组分，监测和定量测定病人血清中生物药剂和抗体滴度可行性，跟踪检测动物模型，人类临床实验和各种台式应用中生物反映物（5）食物检测和环境监控。生物传感器已经应用于测定食物中营养物和抗生素水平，食品中细菌和真菌污染量以及空气或水中传播毒素，杀虫剂和除草剂。生物传感器在线分析能力和高敏捷度，微量样品需求特点，使得这种仪器成为食品及环境安全监控抱负工具。（6）细胞膜模仿。生物传感器金属表面能天然模仿细胞膜组分与可溶性分析物互相作用。大量文献简介了运用Biacore疏水性HPA或亲脂性L1传感器芯片构建杂交脂双层，进行膜模仿研究工作，这些芯片表面稳定性和可重复性使药物，抗体和蛋白结合到脂膜定性和半定量分析成为也许。（7）遗传分析。SPR生物传感器用于遗传分析是一种崭新领域。如用于检测点突变，用于检测区别野生和经遗传修饰大豆基因序列等。总之，随着生物传感器芯片技术，实验办法及数据分析技术不断发展，SPR生物传感器应用领域将不断扩大，技术水平及实用限度将不断提高，有着非常辽阔应用前景。

将来展望

生物分子之间互相作用是生命现象发生基本，研究生物分子之间互相作用可以阐明生物反映机理，揭示生命现象本质。近年来，研究分子互相作用技术不断浮现，其中表面等离子共振在生物学以及有关领域研究应用获得了很大进展，SPR技术可以现场，实时地测定生物分子间互相作用而无需标记，可以持续监测吸附和解离过程，并可以进行各种成分互相租用研究。

如今，SPR技术已被广泛地用来分析生物分子如蛋白质-蛋白质，药物-蛋白质，蛋白质-核酸，核酸-核酸之间互相作用反映动力学，结合位点和反映物浓度等信息，所涉及研究领域涉及免疫辨认，信号传导，药物筛选，抗体定性以及蛋白质构象变化等，SPR技术在分子生物学研究领域中应用范畴非常广，在研究基因工程载体与质粒DNA之间互相作用，以评价载体效率，DNA序列特异性抗体性质鉴定等方面，SPR技术都发挥了重要作用。SPR技术与其她分析技术联合应用，必将加速分子生物学研究进展，使咱们对生命现象理解更加进一步。(生物秀实验频道

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参照文献

1笑梅；高等仪器分析实验与技术；北京大学医学出版社（）

2段媛媛，刘德立。SPR生物传感器特点及其在生物特异性互相分析中应用。生物技术通讯，，13（1）：72-75

3王海明，钱凯先.表面等离子共振技术在生物分子互相作用研究中应用.浙