T-QBAA 001-2023 酿酒酵母培养物中甘露聚糖含量的测定 高效液相色谱法

0ICS65.200CCSB46团 体 T/QBAA001—2023酿酒酵母培养物中甘露聚糖含量的测定高效液相色谱法Siit tDeerminatonofmannancontentinyeasculure(Siit tHighperformancel-

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-中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟 发

布

T/QBAA001—2023前 言本文件按照

GB/T1.化工作导则 第1部分:化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中关村量子生物农业产业技术创新战略联盟化技术委员会提并归口。本文件起草单位:北京农学院、北京中农弘科生物技术有限公司、安琪酵母股份有限公司、安徽东方新新生物技术有限公司、中农业大学、北京大北农科技集团股份有限公司、铁骑力士食品有限责任公司、河北弘科荣达生物技术有限公司。本文件主要起草人:刘明、王宗义、蒋林树、王文欢、覃先武、谢申猛、陆文清、曹云鹤、周建川、白秀梅、董彦君、赵学军、戴晋军、夏冰、徐建晨、周俊言、庞远祥、刘茹、刘运平、赵莉莉、张云常、王慧、刘真。T/QBAA001—2023引 言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及与《一种酵母培养物中甘露聚糖的检测Z方法》(L201710219300.)相关的专利的使用。Z本文件的发布机构对该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下,就该专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得:专利持有人姓名:北京中农弘科生物技术有限公司。地址:北京市昌平区中关村生命科学园北清创意园请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。T/QBAA001—2023酿酒酵母培养物中甘露聚糖含量的测定高效液相色谱法1

范围本文件描述了酿酒酵母培养物中甘露聚糖含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于酿酒酵母培养物中甘露聚糖的测定。2

规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195

动物饲料 试样的制备3

术语和定义下列术语和定义适用于本文件。13.123.2

Siit t酿酒酵母培养物

yeasculureSiit tS以酿酒酵母(accharomycescereviiae)为菌种,经固体发酵后,浓缩、干燥获得的产品。S甘露聚糖

mannan6 2 3以α-1,-甘露糖为骨架链,由α-1,

或α6 2 34

原理样品经酸水解,使甘露聚糖转化为甘露糖,以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮为衍生剂进行衍生,经高效液相色谱分离,紫外检测器检测,外法进行定量。将测得的甘露糖含量通过转化系数校正,计算得到甘露聚糖的含量。5

试剂和材料15. 试剂111125..水:GB/T6682,一级水。11125.. 浓盐酸(HCl):分析纯。1314 ( 2155.. 1314 ( 2155.. 二氯甲烷

CH2Cl):分析纯。5.. 甲醇(CH3OH):色谱纯。1T/QBAA001—2023165.. 乙腈(CH3CN):色谱纯。16175.. 乙酸铵(CH3COONH4):色谱纯。171825..

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(C10H10N2O):分析纯。1825. 试剂配制 6215.. 氢氧化钠溶液(

mol/L):称取120g(精确至0.1g)氢氧化钠,缓缓加入盛有 621水的烧杯中,使其完全溶解,待溶液冷却后,移至500mL容量瓶中,定容。 /(3225..氢氧化钠溶液

0.molL):称取6g(精确至0.1g)氢氧化钠,缓缓加入盛有200 /(322水的烧杯中,使其完全溶解,待溶液冷却后,转移至500mL容量瓶中,定容。 /(3 5235.. 盐酸溶液

0.molL):移取12.mL(精确至0.1mL) /(3 523的烧杯中,待溶液冷却后,转移至500mL容量瓶中,定容。 (5 3245..

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液

0.

mol/L):称取4.5g的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (5 324甲醇溶解

,定容至50mL,即配即用。 /(1 2255.. 乙酸铵溶液

0.molL):称取7.08g的乙酸铵,加入适量水溶解 /(1 225的滤膜后备用。35. 品3C C甘露糖(6H12O6,AS号3458-28-4):纯度≥98%,C C45. 甘露糖溶液4 (415.. 储备溶液

1000mg/L):称取甘露糖品0.5g(精确至0.001g),用水溶解并定容 (4150mL容量瓶中,摇匀,于储液瓶中4℃保存,有效期为7d,使用前放置至室温。 1 (4.425.. 中间溶液(00mg/L):移取5mL储备溶液

5.1)于50mL 1 (4.42配即用。 ( 2)

50 0000 00430 0 013 45.. 系列工作溶液:分别移取中 ( 2)

50 0000 00430 0 013 44.0mL和5.0mL于10mL容量瓶中,用水定容,得到质量浓度分别为5.0μg/mL、0.0μg/mL、20.0μg/mL、0.0μg/mL、0.0μg/mL和50.0μg/mL的系列工作溶液。即配即用。55. 材料5 15152 1 5 :0.535.. 15152 1 5 :0.535..

塑料离心管:5mL,0mL,带螺口盖。5.. 滤膜 22μm,水系。 0p54555..

pH精密试纸:H

范围为 0p54555.. 定量滤纸。6

仪器1236. 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。1236. 分析天平:感量0.001g和0.01g。6. 离心机:转速≥8000r/min。 2 4 14 1566. 高压灭菌锅:工作压力0.MPa~0.MPa,工作温度121℃~134℃ 2 4 14 1566.恒温水浴锅:控温精度±0.

℃。6. 涡旋振荡器

。2时间/minA/%B/%0.00752510.00752511.00010014.00010014.10752520.007525T/QBAA001—20237

样品4按照GB/T20195制备样品,至少200g,粉碎使其完全通过0.25mm

孔径的分析筛,充分混匀,装4入磨口瓶中,备用。8

试验步骤18. 水解15 0 (1.(2. 22确称取0.g~1.g试样(精确至0.001g)于50mL塑料离心管中5 0 (1.(2. 22紧离心管盖,于涡旋振荡器上涡旋2min,充分浸润混匀,全部转入150mL三角瓶中,用50mL水分数次清洗离心管,清洗液并入三角瓶中,塞上瓶口塞,置于高压灭菌锅121℃水解60min。取冷却至室温,使用氢氧化钠水溶液

5.1和5..)调水解液pH

至中性,转移水解液至100mL容量瓶中,用水定容。取适量水解液过滤,滤液备用。高甘露聚糖含量试样,过滤液需适当用水稀释后备用。28. 衍生2(1) 5524

03 l 5223 l 5235 55 2吸取滤液

8.400μL于15mL塑料离心管中,加入0.

mol/L1-苯(1) 5524

03 l 5223 l 5235 55 2(..)、.mo/L氢氧化钠溶液(..)各400μL,充分混匀,于70℃水浴衍生化反应60min。取冷却至室温,加入0.mo/L盐酸溶液(..)00μL,混匀。加入2.mL二氯甲烷,涡旋30s,3000r/min离心5min,弃去下层二氯甲烷相,上层水相使用2.mL二氯甲烷重复萃取3次,最后取上层水相,过0.2μm滤膜,待测定。(4.同样方法对系列工作溶液

5.3)(4.38. 测定3318.. 色谱条件31色谱条件如下。C 63———色谱柱:18柱,柱长250mm,内径4.mm,粒径5μm;C 63———柱温:5℃。22———检测波长:50nm。22———进样量:0μL。1 (5.5

B (1.:0———流动相:A为0.1 (5.5

B (1.:0———流动相流速

1.mL/min。流动相洗脱参考程序见表1。表表1

流动相洗脱参考程序3m ×106

×100%

…………(1m ×106

×100%

…………(1)328.. 曲线的制作32(2)(5.3 1将经衍生化处理后的系列工作溶液

8.

在上述色谱条件下确进样(2)(5.3 1溶液4.)浓度为横坐、峰面积为纵坐,绘制曲线。溶液衍生色谱图见附录

A中图

A.。338.. 试样溶液的测定33 (2)3318... 定性分析:将经衍生化处理后的样品水解液

8. (2)3315 2条件下,试样溶液中目物的保留时间与工作溶液中甘露糖衍生物的保留时间相比,偏差应5 2±2.%范围内。样品水解液衍生色谱图见图

A.。3328... 定量检测:在定性分析的基础上,将得到的峰面积代入曲线方程,计算得最终试样溶液甘露糖的质量浓度。3329

试验数据处理1试样中甘露聚糖的含量按式()计算:19X

=ρ

×V×n

×0.9式中:X

———甘露聚糖含量;μρ

———由曲线计算获得样品水解液中甘露糖的质量浓度,单位为微克每毫升(g/mL);μV

———水解液定容体积,单位为毫升(mL);n

———水解液稀释倍数;9g0.