T-SHZSAQS 00227-2023 乳肉兼用牛ACACA基因标记辅助分子育种技术规范

学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载ICS

65.020.30学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载CCS

B

40 T/SHZSAQS

—2023乳肉兼用牛

ACACA

基因标记辅助分子育种技术规范 石河子市质量标准化协会 发

布学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SHZSAQS 00227—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12 规范性引用文件

....................................................................

13 术语和定义

........................................................................

13.1

分子育种..........................................................................

13.2

标记辅助选择......................................................................

13.3ACACA

基因.........................................................................

13.4 单链构象多态性分析

..............................................................

24 主要仪器

..........................................................................

25 主要试剂和材料

....................................................................

26 样本采集

..........................................................................

27 试验步骤（ACACA

基因标记辅助分子育种方法）.......................................

27.1

基因组

DNA

提取和质检..............................................................

27.2PCR

引物序列.......................................................................

27.3PCR

反应体系.......................................................................

27.4PCR

扩增程序.......................................................................

27.5PCR

产物电泳检测...................................................................

37.6SSCP

多态性分析....................................................................

38 结果判定

..........................................................................

39 废弃物处理

........................................................................

310

安全防护...........................................................................

311

注意事项...........................................................................

3附录

A (资料性）.....................................................................

4学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SHZSAQS 00227—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载 本文件参照

GB/T1.1-2020《标准化工作导则

第

1

部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。津市武清大孟庄镇农业服务中心。武少军、叶翠芳。II学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SHZSAQS 00227—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载乳肉兼用牛

1 范围本文件规定了乳肉兼用牛ACACA基因标记辅助分子育种的术语与定义及主要ACACA基因标记辅助分子育种ACACA基因标记辅助分子育种。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T

19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求DB11T150.1 奶牛饲养管理技术规范

第

1

部分：育种3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1

分子育种分子育种技术是对影响主要经济性状相关基因进行定位，也就是在

DNA

水平上直接选择，这样就消除了各种内外环境因素的影响。3.2

标记辅助选择标记辅助选择是一种充分利用家系，表型性状和遗传标记信息来选育品种的一种方法。标记辅助选择应具备以下条件：（1）群体中要存在多态性且为高度多态，2稳定性；（3）不会引起目标性状的表效应；（4）遗传标记易于检测和识别。3.3

ACACA

基因乙酰辅酶A羧化酶α

基因位于19289kbp合成中起重要调控作用。兔学兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SHZSAQS 00227—2023兔学兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载3.4 单链构象多态性分析是利用DNA或RNA分析技术，用以分析遗传学特征和基因突变。4 主要仪器主要仪器包括：PCR泳槽电泳仪、全自动凝胶成像系统仪、多功能酶标仪、恒温摇床、可调式微量移液器、分光光度计。试验室用水、试验室质量管理应符合GB/T6682、、DB11T150.1相关要求。5 主要试剂和材料主要试剂和材料包括：2×PCR

Master

Mix、2×MarkerⅠ、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）。6 样本采集使用含有EDTA1-3mL下颠倒混匀，在采血管壁上清晰记录牛号。样本保存于℃环境下待用。7 试验步骤（ACACA

基因标记辅助分子育种方法）7.1

DNA

提取和质检参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书对试验样品血液提取DNA，用超微量紫外可见分光光度计（NanoDrop

2000型）和1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。7.2

引物序列上游引物：F:CTCTGCTCCTGGTAGGCATC，下游引物：R:ACAGACCCATTCAGGCAAAC，超纯水溶解、稀释引物，-20℃保存。7.3

反应体系2×PCR

Master

Mix

μ

L，10μ

mol/L上游引物、下游引物各0.4μ

L，μ

LDNA

0.5μ

L，

6.2μ

L。7.4

扩增程序兔学兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SHZSAQS 00227—2023兔学兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载94℃预变性5min；95℃变性30

s；58℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。7.5

产物电泳检测取PCR产物4μ

L与DNA

Buffer2%30min，电泳结束后，在琼脂糖凝胶成像系统下查看结果、拍照，并分析7.6

SSCP

多态性分析PCR扩增产物2.5μ

L与DNA上样缓冲液8μ

L于EP管中混合均匀，9810min℃冰箱内5min10μ

L上样液于非变性聚丙烯酰胺（Acr：Bis=37.5：1）中，200

V预电泳20min后，100V过夜电泳。电泳结束后银染显色，并在白色灯箱上拍照保存。8 结果判定ACACA基因PCR扩增条带为441bp，且条带清晰无杂带（附图1）。PCR-SSCP分析和测序可见ACACAg.13437429

A>T存在AA和TT2和3经基因多态性与泌乳性能关联分析，ACACAAA型为优势基因型，AA型的总产奶量和乳蛋白率显著高于TTACACA基因，可以作为分子标记为荷斯坦奶牛及乳肉兼用牛选育提供科学依据。9 废弃物处理废弃物处理应符合、DB11T150.1相关要求。10 安全防护安全防护应符合、DB11T150.1相关要求。11 注意事项11.1

实验室检测用的试剂和操作流程应建立完整有效的质量安全管理体系。1