澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法

澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法本标准规定了澳大利重植原体候选种的检疫鉴定方法。本标准适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。2.1分类地位澳大利亚植原体候选种(candidatusphytoplasmaaustraliense),软壁菌门(Tendericutes),柔膜菌(randidatusphytoplasma),16SrXⅡ组植原体。2.2检测依据本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。对植物材料进行症状观察，发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测；DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法；PCR技术结合RFL.P技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法；电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体粒体形态。3器材与试剂PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪，高速冷麻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。4检测与鉴定方法4.1症状观察仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状捕述参见附录A.1。选取幼嫩组织(新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织》,切片，用1μg/mLDAPI溶液(4',6二脒基-2-苯基吲哚)染色，在460mm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部鳍管部位有明显的蓝色荧光信号A.1.6分子生物学信息环状基因组大小为879324bp.GC含量为27%,且含有一个3.7kb的质粒。基因组含有约839个阅读框(ORF),其中约500个编码蛋白的基因，337个基因编码假定的蛋白，以UGA为终止密码子。澳大利亚植原体候选种仅编码一个基因用于氧化磷酸化作用，仅编码一个基因用于甘油脂类代谢，缺失ATP合成途径、脂肪酸代谢途径以及二氧化碳固定功能。A.2植原体组胞的富集A.2.1溶液配制植原体细胞富集缓冲液(100mL):无水K,HPO,1.67g,KH₂PO,0.41g,蔗糖10g,牛血清白蛋白0.15g,PVP-102g,维生素C0.53g,用5mol/L的KOH调节pH值至7.6。A.2.2植原体细胞的富集方法称取新鲜样品叶中脉1.5g,加入7mL～8mL.新制备的提取缓冲液，50mg的石英砂，于研体中研磨。冰上放置10min~15min,加入5mL相同的缓冲液并摇晃均匀；将悬浊液转移至15ml.离心管，5000r/min使用预冷的离心转头(BerkmanJA20)4℃离心5min,将上清液移至另一个离心管中，19000r/min离心20min,干燥沉淀并用60℃预热的2mL2%CTAB溶液，重悬沉淀；60℃水浴中温浴，并不定期的摇动。A.3.1溶液配制DNA提取缓冲液12%CTAB(50℃左右溶解),1.4mol/LNaCl,20mmol/L.EDTA,100mmol/L.A.3.2DNA提取方法将1mL富集样品转移至2mL离心管，加入1mL.DNA提取缓冲液；将离心管置于65℃水俗中温俗1h~1.5h,每隔20min左右将离心管顺倒混匀；2000g.4℃离心2min;将离心后的上清液转移至一个新的离心管中，加入三氯甲烷/异戊醇(24/1)1mL,混匀，形成孔浊液；将乳浊液在13000g条件下.离心5min;将上清液转入新管，加入800μL预冷的异丙醇，15000g条件下，离心10min;弃上清液，加入500pl的70%乙醇，在15000g的条件下，离心5min;弃掉上清液，干燥沉淀，加入100pl.的灭菌蒸馏水溶解。其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在-80℃的条件下可以冻存1年。5(资料性附录)电子显微镜观察B.1试剂试材B.1.1锇酸固定液巴比妥-乙酸缓冲液的1%锇酸固定液巴比要钠(C,H₁N₂O₂Na)2.89g乙酸钠(CH₂COONa)1.15g加双蒸馏水至100ml.2%俄酸水溶液12.5mL加双蒸馏水至25.0ml.。混合后用0.1mol/1.盐酸调至pH为7.2,即为1%锇酸固定液，在冰箱保存备用。B.1.2戊二醛固定液一般为25%戊二醛水溶液。可配制在除巴比妥以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。B.1.3环氧树脂Fpon812顺丁烯二酸酐(DDSA)?g二乙基苯胺(D.M,P-30)0.4ml.将Epon812倒入烧杯中，置80℃温箱融化备用。按上述比例，飘序加入DDSA,充分搅拌，待熔化呈透明，至室温，再加入邻苯二甲酸二丁酯，仔细搅排，然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺，边加边搅排，至包埋剂呈红棕色。将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸入蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿干燥备用。B.2实验步骤选取呈现症状的葡萄叶片或者幼敏茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm²,取健康葡萄叶片作为阴性对照。采用戊二醛-锇酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4)清洗三次。然后用1%饿酸后固定2h.PBS清洗三次。采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。脱水后的组织块在丙酮/树脂(1:1)中渗透3d,再在全树脂中渗透1d。用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴入包埋剂。于37℃下24h,45℃下24h,60℃下24h。在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养皿内干燥、保存。B.2.7切片染色采用乙酸双氧铀和柠橡酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴入蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min~30min.然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染液滤纸吸干。将铜网再放入另一蜡盘，滴入柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液滴上，染20min~30min,再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。B.2.8显微镜观察透射电子显微镜观察植原体形态，如A.1.5。(规范性附录)通用引物PCR检测C.1引物序列植原体通用引物：R16F2n:5'-GAAACGACTGCR16R215'-TGACGGGCGGTGTGTAC.2PCR反应体系及参数C.2.1PCR反应体系表C.1PCR反应体系补H₂O至C.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的葡萄叶片DNA为模板。阳性对照；以携带有植原体16SrDNA序列的质粒为模板。PCR反应的空白对照；以水代替DNA模板。C.2.3PCR的反应参数R16F2n/R16R2:94℃/2min;94℃/1min.60℃/30S,72℃/1min.35个循环；72℃10min。C.3琼脂糖凝胶电泳制备1%的琼脂糖凝胶，以DNAMarker作为相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝9(规范性附录)虚拟RFLP指纹图谱分析(R16F2n/R16R2)进行虚拟酶切，选用17种限制性内切酶(A/xI、BamHI、BfaI、BstU1,DraI、EcwRI.HaeⅢ、HhaI、HinTagI).酶切后RFLP图谱如图D.1。此外，使用iPhyelassifier的组(亚组)划分功能(16Srgroup/suhgroupelassificationbasedonsimilaritycoefficient),可以对未知植原体进行组与亚组的分