紫藤花粉生活力的测定（论文）

紫藤花粉生活力的测定摘要本文以紫藤花初开花朵为实验材料，研究了TTC、碘-碘化钾、醋酸洋红3种染色剂测定花粉生活力的效果，离体培养时不同的蔗糖浓度和不同的硼酸浓度对花粉萌发的影响，以此为影响紫藤花花粉活力的最佳方法提供理论依据。结果表明：三种染色剂测定的花粉活力差异显著，TTC染色法（60%）高于碘化钾染色法(36%)和醋酸洋红（30%）。适合紫藤花花粉萌发和花粉管生长的最佳培养基是：15%蔗糖+0.03%硼酸。通过比较染色法和花粉萌发测定法，认为TTC染色法更能准确测定紫藤花花粉活力。关键词：紫藤花粉生活力测定StudiesonMeasurementMethodsofWisteriasinensisAbstract:Thewisteriaflowersopenasexperimentalmaterials,theeffectsofTTC,I-KI,carmineacetate3Determinationofpollenviabilitystaineffect,theconcentrationofsucroseinvitroatdifferentconcentrationofboricacideffectonpollengermination,inordertoprovideatheoreticalbasisfortheeffectofthebestmethodofWisteriapollenvitality.Theresultsshowthatthreekindsofpollenviabilitystaindeterminationofsignificantdifferences,TTCstainingmethod(60%)washigherthanthatofpotassiumiodidestaining(36%)and(30%)aceticacidmagenta.ThebestmediumforpollengerminationandpollentubegrowthofWisteriais15%sucrose,+0.03%boricacid.Bycomparativestainingandinvitroculture,itwasconcludedthatTTCstainingcouldbemoreaccurateforthedeterminationofpollenviabilityofwisteria.Keywords:Wisteriasinensispollendeterminationofviability目录TOC\o"1-3"\h\z1前言 12材料与方法 12.1材料 12.2方法 22.2.1三种染色法测定花粉活力的原理 22.2.1.1I2-KI染色法 22.2.1.2TTC染色法 22.2.1.3醋酸洋红染色法 22.2.1.4花粉萌发培养法 22.2.2染色剂的试验方法 22.2.3花粉萌发测定法方法 22.2.4花粉萌发试验操作方法 32.2.1三种染色法测定花粉活力的原理 33结果分析 33.1不同试剂测定生活力的比较 33.2花粉萌发培养法的生活力结果 34讨论……………………45结论 5参考文献 5致谢 61前言本课题围绕植物花粉活力的理论研究，主要研究紫藤花花粉的活力。在我国花粉活力的研究早已有些年头，国内外各大院校生物专业也做了很多有关于植物花粉活力这方面的研究，马诗钰研究了贴梗海棠花粉生活力与贮藏性[1]，贾文庆研究了垂丝紫荆花粉贮藏及生活力[2]，刘欢研究了新疆3种野生山楂花粉活力研究[3]，在一般的对植物的培育和优质物种相关种子的保存工作中，往往都需要把花粉进行采收和保存，并采用一定的方法进行检测它们的活力。在存在生殖隔离的情况下，比如花期不一致，或者是地理上面的隔离，花粉的采收，保存，和检测他们的活力，花粉的采集，对通过人为的进行授粉进行育种具有非常重要的意义。紫藤，（学名：Wisteriasinensis），又叫做藤萝、朱藤、黄环。是豆科紫藤属的植物，往往攀援着生长，通过缠绕植物或者其他攀援物进行生长。树皮干燥的时候是深灰色的，并不会开裂；一般在春天开放，花的颜色是青紫色的，像蝴蝶一样，有些事深紫色，看起来非常的漂亮。中国经常是在园林后者其他景观方面种植，紫藤对环境保护也有很大的作用，紫藤对CO2和SO2等有害气体有较强的抵抗能力，也能够有效的吸附空气中的粉尘颗粒，已经很广泛的应用在绿化中，紫藤花在民间也多用来制作各种美食，同时紫藤的花朵，茎的皮和果实均可做药。紫藤花可以可以解毒、治疗呕吐和腹泻，紫藤的种子具有非常好的治疗作用，对筋骨疼痛方面的伤痛有很好的疗效，同时还能让酒不会变质。紫藤的皮也是有很好的药用价值的，可以灭杀昆虫，可以缓解疼痛，可以杀死蛲虫等。因此紫藤及赏心悦目、净化环境、又可以作为治疗疾病的药物，集多种功能于一身。目前的研究中，很多文献都是研究紫藤如何种植，如何应用，它们含有哪些有效成分，还有它们有什么样的生物特点等，但是对于它们的花粉和授粉时候有什么生理上的特点，还是很少有人进行研究的有人研究了氯化钙和GA3对盐胁迫下紫藤花粉萌发的影响，存在差异的情况下紫藤的花粉所具有活力才差别、柱头传粉性能的比较,紫藤繁殖发育的一些情况和花粉、柱头生物学特性的研究。本课题着手于探究紫藤花的花粉生活力的测定，及花粉生活力有效方法的探究，为紫藤的保质育种提供理论依据，也丰富紫藤的相关研究的材料，为其他研究提供参考资料。2材料与方法2.1材料本实验材料为廊坊师范学院人文楼前停车场傍边的紫藤花，此地人流相对较少，花呈紫色，美不胜收，为校园绿化的植物之一，从2017年4月20日起，每天9：30采集盛花期微开花朵，实验室中将花药剪下等干燥后收集并密封保存，对采集花粉然后进行实验。2.2方法2.2.1三种染色法测定花粉活力的原理2.2.1.1I2-KI染色法用0.3g碘和1.3g碘化钾在100ml水中溶化即得I2-KI溶液，淀粉是会被I2-KI溶液染成蓝色的。一般来说，可以进行授粉的花粉是像球一样的，里面含有非常多的淀粉；而还没有成熟或者是病变等的花粉往往出现别的形状，里面所含有的淀粉是很少的，实验时I2-KI溶液对花粉进行染色操作，会把那些成熟的发育良好的花粉染成蓝色，那些发育不好的就会别染成黄褐色，在显微镜下可以清晰的观察到该现象，因此，可以用I2-KI染液测定花粉活力。2.2.1.2TTC染色法已经成熟的花粉，他们的有氧呼吸是非常的强的，有氧呼吸进行时会有氧化型辅酶一和还原型辅酶一的产生，他们能够把没有颜色的的TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）进行还原，从而变成红色的TTF（三苯基甲），这样就使得花粉显现出了颜色，但是没有成熟的花粉他们的呼吸作用比较弱，所以产生的这两种物质也相对较少，在进行试验染色的时候，得到的颜色不会出现红色，所以红色的深浅程度就可以判断出花粉的活力强弱。2.2.1.3醋酸洋红染色法活力很强的花粉，他们的外表是球型的，里面含有丰富的淀粉，淀粉对很多物质都有很强的吸附能力，包括醋酸洋红，这样，一旦淀粉吸附了醋酸洋红之后，就会变成红色，而如果是活力低的花粉，里面所含有的淀粉也相对较少，吸附的醋酸洋红也会少，所以颜色相对较浅。因此，颜色深浅就说明了种子的活力高低。2.2.1.4花粉萌发培养法当给予花粉一定的适宜条件，他们可以在培养基上进行发芽。发芽率的高低可以用来用测定花粉的生活力大小。如果培养基使用的是适宜的，则可精确测定出花粉的生活力，但由于不同植物的花粉其需要的发芽条件不同，因此此法测定的结果也只是相对准确。2.2.2染色剂的试验方法在用染色剂染色法的时候，首先要把花药弄破，释放出里面的花粉，在用工具把花粉弄到载玻片上，然后根据所采用的染色法，把I2-KI、TTC、醋酸洋红3种染色剂滴到载玻片上面,等到他们混合一段时间后，再盖上盖玻片，为了实验结果的准确性每组实验都重复多次，在所做的装片中，选择花粉均匀分布的装片进行计数，最好每次观察到的数目都一百以上，做好记录并统计结果。2.2.3花粉萌发测定法方法取花粉在合适的液体培养基和适宜的培养条件下进行萌发，培养到合适的阶段，用显微镜进行观察，记录计算其萌发率，以确定其活力。2.2.4花粉萌发试验操作方法首先要通过前期的预实验来确定哪一个蔗糖浓度和硼酸浓度是实验中最利于紫藤花粉萌发的。设计实验时分别确定最适合的蔗糖浓度和硼酸浓度，确定最适蔗糖浓度的实验设计是：10g琼脂+1000ml蒸馏水，pH5.8，常温，蔗糖浓度分别为0.5%、10%、15%、20%；硼酸对萌发率的影响：10g琼脂+1000ml蒸馏水+蔗糖10g，pH5.8，常温，硼酸浓度分别为0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%；实验之后把他们最合适的浓度用来配制成培养基。取一个盖玻片，然后用合适的浓度配制好所需的培养基，在热的状态西涂在盖玻片上面，然后冷却之后，就把花粉弄到冷却的培养基上面，把盖玻片放在双凹孔上，并把盖玻片正确摆放，重复三次实验。一段时间后，把盖玻片拿下来，在同一片盖玻片上取三个合适的视野进行观察，以花粉管长度超过花粉粒直径的1/2作为萌发标准。萌发率=（萌发花粉粒数/花粉粒总数）X100%。3结果与分析3.1不同试剂测定生活力的比较表1不同染色剂测定花粉生活力结果试剂Reagent生活力Viability%5%显著水平5%SignificantlevelTTCI2-KI醋酸洋红60a36b30c注：表中大小写字母表示P=5%显著差异水平。花粉活力高，就有利于传粉的成功率，对受精成功与否至关重要，从而形象种子的形成和植物的产量，对花粉活力大小进行确定，能够判断花粉在授粉时候的成功率，还能观察活力低的花粉的形态，生理状态、特点等。很多相关的研究的结果都表明，要想既快又有效的测定活粉的活力，染色法是最好的方法。当然不同花的花粉对不同的染色剂敏感程度不同，因此不同的染色法所得到的结果也有所不同，准确性有所差异。从表１中可以明显的得出，TTC染色法实验得出的结果（60%）测得的花粉生活力最高，远高于I2-KI染色法（36%）和醋酸洋红法（30%），而I2-KI染色法和醋酸洋红法结果差异不算大。由此可知，TTC是可以作为测定紫藤花粉活力的方法，而I2-KI染色法和醋酸洋红法不适合作为测定紫藤花粉活力的方法。3.2花粉萌发培养法的生活力结果表2不同浓度蔗糖、硼酸处理对花粉萌发的影响萌发率(%)蔗糖浓度(%)0.5%10.0%15.0%20.0%硼酸浓度(%)06.10%9.60%20.40%17.60%0.01%24.10%38.40%53.80%42.50%0.03%27.30%39.80%67.80%49.70%0.05%20.50%26.40%42.30%36.10%0.07%11.20%16.40%28.80%20.50%不同浓度蔗糖和硼酸组合成不同的培养基进行培养观察，从表2结果可以看出不同培养基对紫藤花粉萌发的影响：在不添加硼酸的情况下，紫藤花粉的萌发率较低，蔗糖浓度为0.5%时萌发率仅为6.10%，而随着蔗糖浓度的增加，呈现萌发率先上升后下降的趋势，最高发芽率仅为20.4%；在低浓度的蔗糖培养基中，当蔗糖浓度较低时，硼酸的浓度低时，紫藤花粉萌发率低，过高时，紫藤花粉萌发率也低，中间浓度时相对较高，最高萌发率仅为27.30%。由此可以看出，在培养基中加入硼酸、蔗糖是可以提高紫藤花粉的萌发率的，并且蔗糖浓度有变化，硼酸浓度不一样，和不同的蔗糖硼酸浓度组合对紫藤萌发率的影响也是有差异的，均体现为，在一定范围内，蔗糖浓度的升高，会促进紫藤花粉的萌发，超过一定浓度后，其促进作用下降，在一定范围内，硼酸浓度的升高，会促进紫藤花粉的萌发，超过一定浓度后，其促进作用下降。由表格实验数据可以看出，0.03%硼酸浓度对紫藤萌发的促进作用最明显，15.0%蔗糖浓度对紫藤萌发的促进作用最明显，其他情况时萌发率均低于该浓度。整体分析可以看得出来，紫藤花花粉萌发的最优培养基蔗糖和硼酸浓度组合为0.03%硼酸+15%蔗糖。

讨论随着大量的研究进行，人们探究出较多的方法来测定花粉的活力，而多数的实验证明染色法是最方便又最快捷的方法［4］。然而由于物种不同，其花粉内所含的物质也有所不同［5］，这就造成同样的染色方法在不同的植物花粉活力测定中会得到不同的结果，其准确性也有所差异［6］，如本实验中I2-KI测定的效果较不理想，并不是测定紫藤花粉活力的快速测定的好方法，这与管雨等［7］对木瓜花粉活力测定的研究有相同之处，有可能是因为花粉中的淀粉含量相对低造成的，但是李刚等［8］的实验结果则得出I2-KI可以准确的测定芍花粉的生活力。本实验中，I2-KI染色法和醋酸洋红染色法的染色结果都不好，两者的结果相差不大，可知都不适合用来测定紫藤花粉的活力。染色法是一种既简单又方便的方法，不过花粉的形态结构和生理状态会影响结果，如不同的花粉硬度、物质的组成成分、相关酶活性的大小等的影响较大［9］，且颜色的判定也与主观上的因素有关，所以结合花粉萌发测定能获得比较准确的效果。当然遗传方面和环境条件也会影响花粉的生活力，花粉取样的时期，花粉放置的时间、温度、湿度等都是影响的因素。呼吸作用的强弱，会使得淀粉、可溶性糖类、有机酸的消耗减少，影响测定结果，因此在实验中尽量在较适宜的条件下进行。研究表明，不属于同一个物种的植物，或者是即使是同一个物种但是不同品种的植物，在采用花粉萌发培养法时所需营养物质组成、需要的浓度及实际萌发率均差异较大，如程伟等［10］的所做的实验中，对西南桦来说，它的花粉萌发时最优的组合为15%蔗糖＋200mg/kg硼酸＋30°C，这时花粉的萌发率是30.3%，花粉萌发培养法的实验中萌发率最好的的培养基组合为蔗糖8%＋硼酸0.03%＋温度20°C，萌发率为22.23%，比单一影响因素所得的结果要高，但都低于染色法得到的结果，而反过来，贾文庆等［11］研究发现，紫薇花粉用离体培养法测得的结果很好，但通过染色法测得的活力较低，这应该是实验室所提供的模拟环境，并无法提供与自然生长一致的环境，如营养物质方面的差异，并不完全紫藤的自然生长发育条件。本实验中，用TTC染色法得到的结果是花粉活力为60%，I2-KI染色法表明花粉活力为36%，醋酸洋红染色法测得30%花粉有活力，蔗糖和硼酸浓度组合为0.03%硼酸+15%蔗糖测定的结果为67.8%，可见TTC染色法和花粉萌发测定法所得到的结果比较符合，所以TTC可作为测定紫薇花粉活力的方法。

5.结论本实验通过实验和对比可以得出，TTC染色法和花粉萌发测定法都可以作为测定紫藤花粉活力的方法，作为紫藤花粉活力测定的有效方法，TTC染色法可以作为快速测定紫藤花粉活力的方法，紫藤花粉萌发法比较好的蔗糖和硼酸浓度组合为0.03%硼酸+15%蔗糖测定的结果为67.8%。在后续研究中，可以研究影响这