《畜禽魏氏梭菌病诊断技术规范》

畜禽魏氏梭菌病诊断技术规范     范围本文件规定了畜禽魏氏梭菌病诊断的术语和定义、临床诊断、病原菌的分离培养、病原菌的鉴定与结果判定、生物安全。本文件适用于畜禽魏氏梭菌病的诊断、检疫、监测及流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求NY/T3073家畜魏氏梭菌病诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T2754.10出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第10部分：产气荚膜梭菌SN/T2979兔魏氏梭菌病检疫技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。魏氏梭菌（Clostridiumwelchii）又称产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens），一种厌氧的革兰氏阳性梭状杆菌，有荚膜、有芽孢、无鞭毛、不运动，广泛存在于土壤、水体、饲料、粪便和动物肠道中，可感染牛、羊、猪、兔、鸡、鸭、鹅等多种畜禽及野生毛皮动物。血清型（Serotype）魏氏梭菌主要产生α、β、ε和ι四种致病性外毒素，根据毒素的产生情况可将该菌分为A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）五种血清型。魏氏梭菌病（Clostridiumwelchiidisease）牛魏氏梭菌病又称牛猝死症，由A型魏氏梭菌引起的牛的急性传染病，发病率低，致死率极高，以突然死亡、实质器官以及消化道大量出血为特征。羊魏氏梭菌病由魏氏梭菌引起的羊的传染性疾病，发病急、病程短、病死率高，包括羔羊痢疾（B型魏氏梭菌）、羊肠毒血症（D型魏氏梭菌）、羊猝狙（C型魏氏梭菌）和羊黑疫（B型魏氏梭菌）。猪魏氏梭菌病又称猪梭菌性肠炎、猪传染性坏死性肠炎、仔猪肠毒血症（俗称仔猪红痢），是由A型或C型魏氏梭菌感染猪引起的一种急性消化道传染病。兔魏氏梭菌病又称兔梭菌性肠炎，主要由A型或E型魏氏梭菌引起的一种肠毒血症。禽魏氏梭菌病主要由A型或C型魏氏梭菌感染禽类引起的一种以坏死性肠炎为特征的急性传染病。临床诊断牛魏氏梭菌病牛魏氏梭菌病的临床诊断参照NY/T3073的规定执行。羊魏氏梭菌病羔羊痢疾4.2.1.1流行病学1月龄内羊羔易感，多由母羊营养不良、产羔季节寒冷或炎热诱发。4.2.1.2临床症状呈急性或亚急性经过。初期发热，精神沉郁，食欲减退或废绝，低头弓背，喜伏卧，头颈向后弯曲。随后持续性腹泻，排黄色或带血稀便。后期大便失禁，极度脱水后死亡。4.2.1.3病理变化胃内有凝乳块。实质器官肿大、变性。小肠呈出血性肠炎变化，黏膜上有溃疡斑。羊肠毒血症4.2.2.1流行病学2~12月龄羊在春夏或秋冬换季时易感。4.2.2.2临床症状突然死亡或出现症状后2~4h死亡。哀鸣，呼吸急促，倒地抽搐，角弓反张，眼结膜和口黏膜苍白，有浓稠胶冻状的黄色鼻液，排黄褐色水样稀粪，腹部通常不发生臌气。4.2.2.3病理变化心外膜有出血点。肾脏充血、肿胀、软化。小肠黏膜充血、出血，肠壁有溃疡斑。羊猝狙4.2.3.1流行病学6~24月龄羊易感，低洼沼泽地区多发，呈地方流行性。4.2.3.2临床症状发病急，3~6h内死亡。病羊突然沉郁，剧烈痉挛，倒地咬牙，眼球突出，惊厥而亡。4.2.3.3病理变化小肠呈出血性肠炎变化，空肠溃疡或糜烂。肾脏肿大，但质不软。死亡8h后骨骼肌中呈现气肿疽样病变。羊黑疫4.2.4.1流行病学2~4岁、营养状况较好的膘肥羊易感，潮湿低洼的沼泽地草场多发，夏秋季节多发。4.2.4.2临床症状突然死亡。少数病程持续1~3天，食欲不振，反刍停止，发热，呼吸急促，口鼻含淡黄色液体，俯卧在地，昏睡状态下死亡。4.2.4.3病理变化皮下静脉淤血，胸部皮下组织水肿。心内膜有出血点，心包积液。腹腔积液，呈黄色，在空气中暴露后凝固。肝脏肿大、充血，有灰黄色坏死灶，呈不规则的圆形。小肠黏膜和真胃幽门充血、出血。猪魏氏梭菌病猪魏氏梭菌病的临床诊断参照NY/T3073的规定执行。兔魏氏梭菌病兔魏氏梭菌病的临床诊断参照SN/T2979的规定执行。禽魏氏梭菌病流行病学无明显流行季节，各品种和各年龄段的禽类均易感，2周龄~6月龄多发。传播途径以消化道为主。该病通常与多种应激因素协同发生，如球虫感染、饲料中淀粉和蛋白质含量过高、饲料变质、低温等。临床症状病禽精神沉郁，采食量下降，眼睑肿大，羽毛蓬松杂乱，排黄色粥样稀粪。随病程发展，排出红色或煤焦油状的恶臭味粪便，混有血块和组织碎片，迅速消瘦，急性死亡。病理变化肠道表面呈乌黑色，小肠后段肠管扩张，充满气体。剪开可见黑褐色肠容物，肠黏膜坏死、脱落、有出血点，表面覆有棕褐色或黄色麸皮样物质。结果判定如动物表现出上述典型的临床症状和病理变化，结合流行病学，可判定为魏氏梭菌病疑似病例。病原菌的分离培养样品的采集、保存与运输病畜禽组织、肠内容物、粪便等病料样品的采集、保存与运输按照NY/T541的要求执行。细菌分离培养接种无菌条件下进行。肠内容物和粪便用1mL生理盐水稀释，接种至血琼脂平板和胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）平板。平板的配制按照GB4789.28的规定进行。组织经表面消毒后可直接用于细菌分离。培养接种后的平板在45℃、厌氧环境（含5%CO2的厌氧培养箱、烛缸或含厌氧产气包的厌氧培养缸）中倒置培养12h。菌落形态观察与结果判定菌落在血琼脂平板上呈圆形、直径2~5mm、有双溶血环，在TSC平板上有黑色中心，可判定为魏氏梭菌疑似菌落。病原菌的鉴定与结果判定生化鉴定与结果判定生长试验按照SN/T2979中规定的方法，挑取疑似菌落，用厌氧肉肝汤和牛乳培养基进行生长试验。生化鉴定按照NY/T3073的规定进行生化试验。结果判定厌氧肉肝汤中培养后浑浊，产生大量气泡；牛乳培养基中培养后呈现“爆裂发酵”，牛乳变成多孔的海绵状凝块；并且疑似菌落的生化特性符合NY/T3073的要求，可确认该菌为魏氏梭菌。16SrRNA基因的PCR检测方法与结果判定PCR检测引物针对魏氏梭菌的16SrRNA基因（GenBank登录号：NR_121697）设计PCR检测引物。上游引物序列：5ʹ-TAACCTGCCTCATAGAGT-3ʹ；下游引物序列：5ʹ-TTTCACATCCCACTTAATC-3ʹ。扩增片段大小为481bp。样品制备与反应体系配置被检样品的制备、核酸抽提和反应体系的配置按照SN/T2979的规定操作。魏氏梭菌参考菌株（ATCC13124）的基因组作为阳性对照，无菌双蒸水作为阴性对照。PCR反应条件预变性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸5min，结束反应，4℃保存。电泳配制1.5%的琼脂糖凝胶，添加工作浓度的核酸染料。取5μLPCR产物进行电泳，同时用DNAMarker作为分子量参考。用凝胶成像系统观察分析电泳结果。结果判定阳性对照扩增出481bp的条带，同时阴性对照未见有PCR扩增条带，检测结果成立。被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性，可确认为魏氏梭菌；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。16SrRNA基因的LAMP检测方法与结果判定