DB21-T 3084-2018羽绒制品中鹅绒的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法

ICS59.080

W59

备案号：62065-2019DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3084—2018

羽绒制品中鹅绒的鉴别

PCR法和实时荧光PCR法

IdentificationofGooseDownFiberinFeatherandDownProducts

-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod

DB21/T3084—2018

羽绒制品中鹅绒的鉴别PCR法和实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了羽绒制品中鹅绒的PCR和实时荧光PCR鉴别方法。

本标准适用于羽绒制品。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

3.1聚合酶链式反应polymerasechainreaction

一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物

为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性—退火—延伸的循环反应，使极少量的DNA

的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。

3.2实时荧光PCRreal-timefluorescencepolymerasechainreaction

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未

知模板进行定量或定性分析的方法。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对（basepair）

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

DTT：二硫疏糖醇

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

5原理

用试剂盒法或其他等效DNA提取法提取样品中的DNA。针对鹅的线粒体DNA序列设计引物和探

针，通过单PCR、实时荧光PCR技术，对DNA中的鹅成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判

定样品中是否含有鹅绒。

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6试剂

6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。

6.2组织和毛发提取试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRa

Code.9765)。参见附录A中A.1。

6.3PremixExTaq™(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)参见附录A中A.2。

6.4100%乙醇。

6.5溴化乙锭溶液。

6.6DNALaddarMarker。

7设备与器具

7.1PCR仪

7.2实时荧光定量PCR仪

7.3电泳装置

7.4凝胶成像仪

7.5冰箱：4℃~20℃

7.6天平：精度为0.0001g

7.7分析研磨机

7.8微孔干浴器或水浴锅

7.9瞬时离心机

7.10涡旋混合器

7.111.5mL磁分离架

7.12微量可调移液器：0.1μL~2.5µL，1µL~10µL，2µL~20µL，10µL~100µL，20µL~200µL，

100µL~1000µL。

7.131.5mL离心管，2.0mL离心管

7.14PCR薄壁管

7.15实时荧光PCR光学反应管

7.16超净工作台

8取样

从羽绒服或其他羽绒制品的不同部位取样，混合均匀后，再取约1g试样。

9制样

将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再次尽量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨机混匀。

10DNA的提取

10.1组织裂解

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称取约5mg试样，放入2mL离心管中，每个样平行提取2管，加入180µL的缓冲液GL（Buffer

GL）、20µL的蛋白酶K（ProteinaseK）和10µL的核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL），于56℃

水浴温浴至组织完全裂解3小时。如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12,000rpm离心2分

钟，去除杂质之后再进行后续操作。向裂解液中加入200µL缓冲液GB（BufferGB）和200µL100%

乙醇，充分吸打混匀。

注：温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。

10.2将核酸纯化柱（SpinColumn）安置于收集管（CollectionTube）上，溶液移至核酸纯化柱中，12,000

rpm离心2分钟，弃滤液。

10.3将500µL的缓冲液WA（BufferWA）加入至核酸纯化柱中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

10.4将700µL的缓冲液WB加入至核酸纯化柱中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

10.5确认缓冲液WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

10.6沿核酸纯化柱管壁四周加入缓冲液WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

10.7重复操作步骤4。

10.8将核酸纯化柱安置于收集管上，12,000rpm离心2分钟。

10.9将核酸纯化柱安置于新的1.5mL的离心管上，在核酸纯化柱膜的中央处加入50µL~200µL的

灭菌水或洗脱液（ElutionBuffer），室温静置5分钟。

10.10将灭菌蒸馏水或洗脱液加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

10.1112,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到核酸纯化柱膜的

中央或再加入50L~200µL的灭菌水或洗脱液，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。

11DNA的鉴别

11.1质量控制

进行PCR、实时荧光PCR鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增鹅成分时

用鹅绒DNA。阴性对照：扩增鹅成分时用非鹅绒DNA，空白对照：实验用水。

11.2PCR法

11.2.1引物

所用引物信息见表1。

表1PCR扩增所用引物

扩增成分引物名称引物序列退火温度/℃产物大小/bp

Goose-cytb-F5’-GCTACTAGCCATACACTAC-3’60.3375

鹅

Goose-cytb-R5’-GTTGGATTGTCTACTGAGA-3’60.0375

11.2.2PCR反应体系

premixExTaq(2×)12.5µL，10µmol/L引物各1µL，DNA模板2µL，ddH2O8.5µL

11.2.3反应条件

95℃，30s；95℃，5s，退火温度（见表1），60℃，30s，40个循环。

注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。

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11.2.4PCR产物的检测

将适量5×TBE稀释成0.5×TBE溶液，配制2.0%琼脂糖凝胶，取15µLPCR产物，点样进行电泳，

并加DNAmarker点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3

V/cm~5V/cm长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（10

µg/µL）中浸泡30min。用凝胶成像系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。

11.2.5PCR结果及判断

阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小

的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一

步确证。

11.2.6结果确证实验

可疑阳性结果的采用实时荧光PCR法进行确证。

11.3实时荧光PCR法

11.3.1引物及探针

所用的引物、探针见表2。

表2实时荧光PCR所用引物、探针

扩增成分引物名称引物序列退火温度/℃产物大小/bp

Goose-cytb-F5’-GCTACTAGCCATACACTAC-3’60.3375

鹅Goose-cytb-R5’-GTTGGATTGTCTACTGAGA-3’60.0375

Goose-cytb-P5’-（FAM）CGCAGACACTTCACTCGCCT（Eclipse）-3’70.0375

11.3.2PCR反应体系

PremixExTaq(2×)12.5µL，PremixExTaq(2×)12.5µL，PrimerF(10µM)1µL，Primer

R(10µM)1µL，Probe(5µM)1µL，DNA×2µL，dH2O7.5µL，×Negativecontrol反应时，加入

RNasefreedH2O，×Positive反应时，做2个平行样。

11.3.3PCR反应条件

95℃，30s；95℃，5s，退火温度（见表2），60℃，30s，40个循环。

注：不同仪器可根据仪器要求和PremixExTaqTM使用说明书将反应参数作适当调整。

11.3.4结果分析

反应结束后，应设置无效基线范围，基线范围选择在3~15个循环，如果有强阳性样本，应根据实

际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为

准。设置阈值后，分析样品的检测结果。

11.3.5结果判断

待测样品鹅成分检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在23~30之间者，阴性对照、阳性

对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出鹅源性DNA成分。

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待测样品鹅成分检测Ct值小于或等于36，内参照基因检测Ct值在20~30之间者，阴性对照、阳性

对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出鹅源性DNA成分。

待测样品鹅成分检测Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小

于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出鹅源性DNA成分；再次

扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照/阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出鹅源性DNA

成分。

11.4结果表述

该样品未检出鹅源性DNA成分，

该样品检出鹅源性DNA成分。

12防止污染的措施

检测过程中防止交叉污染的措施参照GB/T19495.2。

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AA

附录A

（资料性附录）

试剂盒

A.1试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRaCode.9765)

组成（50次）

本试剂盒分试剂PartI与PartII两部分。

PartI-20℃保存

蛋白酶K（proteinaseK，20mg/mL）1mL

核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）0.5mL

PartII室温（15-25℃）保存

缓冲液GL（BufferGL）×112mL

缓冲液GB（BufferGB）×112mL

缓冲液WA（BufferWA）×128mL

缓冲液WB（BufferWB）×224mL

洗脱液（elutionbuffer）14mL

离心管（SpinColumns）50支

收集管（Collectiontubes）50支

A.2试剂盒PremixExTaq™(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)

组成（50µL反应×200次）

PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×Conc.）×11.0mL×5支

ROXReferenceDye（50×Conc.）×2200µL×1支

ROXReferenceDyeII（50×Conc.）×2200µL×1支

非商业性声明：附录A所列参考试剂盒仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试使

用不同厂家或型号的试剂盒及试剂。

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BB

附录B

（资料性附录）

扩增产物序列

鹅扩增产物序列（375bp）

Attcctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctga

atcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatt

tctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagccttcataggctatgtcctcccgtgaggcc

aaatatcattctgaggggccacagtaattacaaacttactatccgccatcccatacattgggacagacctagttcaatgaatctgagga

ggctactcagtagacagtcccac

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参考文献

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