9工业微生物育种

9.工业微生物育种

●工业化菌种的要求①能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物;②有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强;③遗传性能要相对稳定;④不易感染它种微生物或噬菌体;⑤产生菌及其产物的毒性必须考虑〔在分类学上最好与致病菌无关〕;⑥生产特性要符合工艺要求.●工业微生物的来源：—索取或向菌种保藏机构购置；—自己选育(1)用原有菌株进行遗传改造进行育种①

诱变育种②

基因重组育种(2)向菌种保藏机构索取、购置出发菌株进行选育；(3)从自然界中别离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。●别离微生物新种的根本步骤：包括采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。典型的筛选方法(见左图)①采样从自然界种采集含目的菌的样品

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环境条件对土样本中微生物分布的影响—营养环境ⅰ.高糖环境(加工蜜饯、蜂蜜的环境)土壤：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌ⅱ.富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤：淀粉酶产生菌ⅲ.森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌ⅳ.含蛋白质(蚕丝、豆饼、生皮晒厂)土壤：蛋白酶产生菌ⅴ.油田土：石油分解菌例：醛肟水解酶的筛选--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%Z-PAOx每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基样品分析，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释别离条菌落—水分ⅰ.离地表5-25cm土样ⅱ.含水过多、过少都不理想—温度：采样以秋季为好—通风:—植被：根局部泌物对微生物分布的影响—酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸★采样方法ⅰ.去除表层土ⅱ.取5-25cm土样10-25g，装入无菌牛皮纸袋或塑料袋中★注意ⅰ.记录：时间，地点，环境情况等ⅱ.样品袋应封好口，防止水分失去ⅲ.土样应在别离前破碎ⅳ.尽快别离②增殖培养〔富集培养〕ⅰ.适用：样品中目的菌数量不够多时ⅱ.目的：提高样品中目的菌的数量和比例ⅲ.原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制ⅳ.方法：★控制营养成分

—纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌—可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种—酒精废水，可以增殖废水利用菌注：多种微生物所利用的碳/氮源不能作控制因素★控制培养基pH—细菌、放线菌：中性偏碱，—真菌：偏酸注：但非目的菌的生长不能被完全抑制★

控制培养温度—30℃左右培养，可培殖嗜温微生物—50～60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株★

热处理—增殖芽孢细菌样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌★添加抑制剂—10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌—抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌—多粘菌素B：抑制G-细菌—青霉素：抑制G+细菌—制毒菌素：抑制真菌—放线菌酮：抑制真菌

③纯种别离目的：将目的菌从混杂的微生物中别离出来，获得纯培养★一般方法—稀释平板法(倾注平板或涂布平板)—划线法稀释别离涂布平板稀释别离倾注平板划线别离法—组织培养法适用于别离高等真菌及植物病原菌。高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→置琼脂平板上→培养→长出菌丝体或：→悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内→培养→长出菌丝体注意：对蔓延性霉菌ⅰ.加1%去氧胆酸钠ⅱ.察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖ⅰ.纸片培养显色法滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基用接种环接种保湿恒温培养据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量ⅱ.透明圈法根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸钙平板透明圈：产酸酪素〔蛋白〕透明圈：蛋白酶★平皿反响快速检出法—定性或半定量ⅲ.变色圈法淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶变色圈反响ⅳ.生长圈法工具菌：营养缺酸型，不能合成的物质〔生长因素〕为目的菌积累的产物菌落形态明显不同于目的菌方法：106~107工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基外表，具有生长圈的菌落即为目的菌适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育ⅴ.抑制圈适用：抗生素产生菌的选育工具菌：对目的抗生素敏感的微生物例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法目的菌别离：稀释别离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器〔6CM〕将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的上下琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序包含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈。指示剂直接掺入或喷洒到固体培养基上，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液。固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌,如待筛选菌具将有该营养物的前体转化成营养物能力,工具菌就能围绕该菌生长.待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质④厌氧性微生物的别离法ⅰ.去除培养基中的溶解氧，降低Eh煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V以下培养基预复原：将培养基中参加复原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Ehⅱ.创造无氧环境物理除氧空气置换法：枯燥器或厌氧培养罐抽真空76mmHg→充入N2〔反复3次〕→充入CO210%+H210%+N280%化学除氧H2+O2→H2O(钯作催化剂〕GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反响产生H2和CO2，H2与O2反响生成水厌氧指示剂ⅲ.厌氧别离〔培养〕技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术GasPak⑤筛选—初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的别离菌株中的低产菌培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定，如培养基组成，通风量〔装液量，摇瓶机转数〕，pH、温度、培养时间等。分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法—复筛：每株3-5瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，3-5%接种量，培养条件可同初筛分析测定：定量，注意副产物

复筛可进行屡次，逐步淘汰，留下3-5株甚至最好的1株初筛和复筛的比较⑥培养工艺条件试验与生产试验—摇瓶发酵条件培养基组成，初始pH，通风量〔装液量〕，接种量，培养温度…—小型台式发酵罐发酵工艺条件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…9.1.1紫外线诱变

造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反响

机理交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。

物理诱变紫外线化学诱变5-溴尿嘧啶引起DNA复制错误

9.1诱变育种嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多胸腺嘧啶二聚体嘧啶的紫外线光化产物●胸腺嘧啶二聚体的修复①光复活作用微生物等生物的细胞内存在光复活酶

光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物翻开二聚体,将DNA复原。可见光光能(300-500nm)激活光复活酶此时的光复活酶没有活性PRE为光复活酶

②暗修复作用一种不需要光激活的修复体系。可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。切开二聚体的5’-末端,形成3’-

OH和5-P的单链缺口从5’-P到3’-OH方向切除二聚体,并扩大缺口以另一条互补链为模板,从原有链上暴露的3’-OH端起合成缺失片段将新合成链的3’-OH与原链的5’-P相连接方便、诱变效果很好的常用诱变剂参数：紫外灯功率、工作距离、照射时间●紫外诱变的特点〔自学〕9.1.25-溴尿嘧啶诱变-碱基类似物

机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应。

酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似，与A配对

5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构

A：T

G：C

烯醇式5-BU不与A而与G配对9.1.3诱变育种的根本过程如下：●出发菌株的来源与选择①一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力,即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。②其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状,如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。③诱变的菌株在遗传性状上是稳定的,即遗传上同质。因此,诱变育种要选择单倍体或单核细胞作为出发菌,也就是要选择纯种。菌株来源自然界直接别离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株已经历屡次育种处理的菌株●菌悬液的制备①用于制备单细胞菌悬液的斜面培养物要年轻、健壮，而且一般要求新鲜的斜面培养物处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。②悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞时机均等并充分地接触，防止出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。

产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。③菌悬液的细胞浓度控制为：真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水〔0.85%NaCl〕稀释。●诱变处理②在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择适宜的处理剂量。①诱变剂的选择。诱变剂主要是DNA上某些位点发生作用，如紫外线产生嘧啶二聚体；亚硝酸脱氨基变酮基；亚硝基胍用于营养缺陷型突变体的诱化；移码诱变剂诱化质粒的脱落等。③就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但到达一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。致死率在70%-80%.一般地,诱变剂对产量性状的诱变作用为:剂量大(小),杀菌率高(低),负变株多(少),正变株少(多),但少(大)量正变株中可(难)筛选到产量大幅度提高的菌株。④诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理,使它们产生协同效应●菌种的筛选分为随机筛选和平板菌落预筛选两种方法。前者是随机挑选平板菌落进行摇瓶筛选；后者是根据某种代谢产物的特异性，所设计出的检出目标突变株的一种精巧的平板筛选方法。复筛:应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平(多级水平筛选)。筛选根本策略筛选根本方法初筛:要力求快速、简便。

①根据菌体形态变异预筛选平板菌落预筛选可分为以下几种方式：②根据平板菌落生化反响直接挑取突变株—采用指示剂筛选高产菌株如Glu产生菌的平板预筛法,常在培养基中参加溴百里酚兰指示剂,培养后在蓝色平板菌落周围出现黄色,根据直径大小,初步筛选出优良的突变株。—酶类产生菌的平板预筛法如淀粉酶产生菌的预筛法:以淀粉为底物制成平板,诱变后的菌体涂布平板,菌落形成后,用碘液浸涂,根据菌落周围的无变色区大小,决定取舍。③根据浓度梯度法挑取突变株抗生素产生菌合成抗生素的能力与其对自身抗生素的抗性有关。一般地，这种抗性越高，其生产能力也越高。摇瓶培养摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中,振荡培养,然后,再对培养液进行分析测定。对于多级水平的摇瓶培养，应尽可能的保证培养条件的一致性，即三角瓶的大小、培养液的量、纱布的层数、摇床转速、温度以及pH等等。另外，还应该注意培养条件应尽可能的与发酵条件接近。因为，高产菌株选育的最终目标是生产上的应用。●常见突变株的筛选①营养缺陷型突变株根本培养基(mimimalmedium,MM):营养贫乏,氮源由无机物组成,不含AA、Vitamin和核酸碱基等有机物,野生型能生长,营养缺陷型不能生长。补充培养基(supplementarymedium,SM):根本培养基上参加某一营养缺陷型菌株不能合成的营养因子,只能满足该营养缺陷菌株和野生型菌株的生长。完全培养基(completemedium,CM):营养丰富，碳源和氮源都是一些有机物，能满足各种营养缺陷菌株和野生型菌株的生长。诱变和营养缺陷菌株的富集诱变剂采用亚硝基胍、亚硝酸和紫外线等。富集手段常采用抗生素法(细菌和酵母菌)、菌丝过滤法(真菌和放线菌等丝状菌)和高温杀菌法(产芽孢菌的芽孢和营养体对热敏感的差异性)等。营养缺陷菌株的检出常采用的检出方法有:点植对照检测法、限量补充法、影印法、夹层法等。夹层培养法点植对照法影印法营养缺陷菌株的鉴定通常采用生长谱法和组合补充培养基法来鉴定。生长谱测定:在同一培养皿上测定一种营养缺陷型菌株对许多生长因子的需求情况。②抗噬菌体菌株的选育效价:每毫升试样中所含有的噬菌体的数量。原噬菌体:浸入到细菌的温和噬菌体，其DNA整合到宿主染色体上,不能成为原有的颗粒形态,这种隐秘状态的噬菌体称为原噬菌体。复愈:溶源性细菌以偶然的时机失去原噬菌体而成为非溶源性细菌的过程。免疫性:溶源性细菌对同一类噬菌体具免疫性，表现为释放的成熟噬菌体，即使附着在溶源性细菌的CW上，或者已经浸染，但不能在细胞内繁殖的现象。噬菌体的别离与效价测定—快速测定法将噬菌体和对数期敏感细胞悬浮液与含0.5－0.8％琼脂培养基混合,加到无菌载玻片上平展凝固培养后,观察噬菌斑并计数。—双层琼脂法菌液+噬菌体试样+琼脂培养基(1%琼脂)噬菌斑数=试样中噬菌体数培养10天计数噬菌斑琼脂平板(2%琼脂)抗噬菌体的选育—高浓度噬菌体原液的制备①专一性噬菌体的获得与纯化②高效价噬菌体原液的制备③噬菌体原液效价的测定效价(单位/mL)＝平均每皿噬菌斑数×稀释倍数×取样量折算例如:噬菌体原液稀释倍数为107,取样量测定量为0.1ml(那么折算数为10),三个平板的溶菌斑数目分別为275、252、263,那么噬菌体原液的效价为:1/3(275+252+263)×107×10＝2.63×1010(pfu/ml)。—诱变与抗性噬菌体菌株的别离—液体摇瓶振荡培养—进一步考察抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性。抗性菌株的特性研究①抗性菌株的稳定性研究②抗性菌株的产量性能研究③抗反响阻遏和抗反响抑制突变菌株的选育抗阻遏和抗反响突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。通常采用结构类似物筛选抗性突变株指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质。主要用于末端产物的积累将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。它包括亲本的选择、原生质体的制备与再生、原生质体的融合、融合子别离以及遗传特性分析与测定五大步骤。9.2体内基因重组育种接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组。●原生质体融合原生质体融合的一般原理和过程：①亲本的选择选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株为了能明确检测到融合子,参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记,如营养缺陷型或抗药性等。②原生质体制备

细胞壁的去除是原生质体制备的关键。去壁的方法有三种:机械法、非酶别离法和酶法。—革兰氏阴性菌不能直接溶壁,只有当乙二胺四乙酸〔EDTA〕存在时,某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。金黄色葡萄球菌

溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶—葡萄球菌素溶解—革兰氏阳性菌如微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌的细胞壁主要由肽聚糖组成。采用溶菌酶破壁。—放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶。—真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成青霉菌多用纤维素酶和

-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用

-1,3-糖苷酶和

-1,4-糖苷酶等酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质蜗牛酶▲在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。▲在菌体生长对数期参加适量青霉素,就能使细胞对溶菌酶更敏感。原生质体制备的其他因素：▲一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。▲菌龄:对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低,对溶菌酶敏感。▲培养基中添加甘氨酸,可以使菌体(放线菌)较容易被酶解聚乙二醇〔PEG〕能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%。采用电融合仪:在高频电场下,用直流电穿孔来进行融合。使原生质体重新长出细胞壁,恢复完整的细胞形态结构。③原生质体融合

④原生质体再生不同微生物的原生质体的最适再生条件不同,最重要的一个共同点是都需要高渗透压。⑤融合重组子的筛选把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上,使亲株和重组子都再生成菌落,然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。间接法直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子融合重组的频率=两亲株原生质体再生菌落的总数融合重组子●杂交育种进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示阻碍了杂交育种手段的实际应用●基因工程育种这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。基因工程的应用仍有很大的局限性：

②蛋白质类以外的发酵产物〔如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物〕产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证③基因工程〔包括代谢工程〕还难以完全取代传统的菌种选育方法①基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质

DNAShuffling技术—体外同源重组技术来源不同但功能相同的一组同源基因用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段并组成文库互为引物和模板，进行PCR扩增，引起模板转换，重组因而发生克隆并选择正突变体选择正突变体作新一轮的体外重组根本步骤(1)用DNaseI消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反响重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装配过程中被证明有低水平点突变产生。3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。④代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。10.菌种的衰退、复壮及保藏●菌种的衰退与复壮的概念衰退的原因：①基因突变，②别离现象。①菌落和细胞形态的改变；②生长速度缓慢，产孢子越来越少；

常见的衰退现象：③抵抗力、抗不良环境能力减弱等；(1).衰退〔degeneration〕：(2)菌种的复壮：狭义的复壮：指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种别离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以到达恢复该菌原有典型性状的措施。广义的复壮：指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的别离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变〔正变〕不断地从生产中选种。③淘汰已衰退的个体〔采用比较剧烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体〕。菌种的复壮措施：①纯种别离：平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等。②通过寄主体内生长进行复壮如Bacillusthuringiensis的复