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基因诊断的技术

基因诊断的技术（一）核酸分子杂交探针（probe）：一段与目的基因或DNA片段互补的特异的单链核苷酸序列示图ASO探针斑点杂交示图（等位基因特异性寡核苷酸）Southern(DNA)印记杂交:示图16-3①限制酶酶切DNA②电泳分离③碱变性④Southern印迹转移⑤与标记探针杂交⑥放射自显影ASO探针斑点杂交PKU,AR正常探针突变探针临床遗传学（二）聚合酶链式反应（PCR）PCR、实时荧光定量PCR（三）DNA芯片技术大规模集成的固相点杂交多种探针固定于芯片（四）荧光原位杂交(FISH)（五）比较基因组杂交患者和正常人基因组DNA探针两重荧光强度比值（六）多重探针连接扩增（MLPA）多重探针杂交、连接及PCR扩增（七）单链构象多态性（SSCP）纯合型正常2条带与纯合型突变2条带位置不同，杂合型突变有4条带。示图变性高效液相色谱（DHPLC）杂合型突变的扩增产物变性再复性，形成2种异源杂合双链和2种同源纯合双链，2种异源杂合双链（部分错误配对）较2种同源纯合双链（全部正确配对）更容易变性，先从色谱柱上被洗脱，故呈现早些4个单链峰和晚些4个单链峰。纯合型正常2个单链峰与纯合型突变2个单链峰不同。高分辨率溶解曲线HRM杂合型突变的扩增产物变性再复性，形成2种异源杂合双链和2种同源纯合双链，4种分子复性速度不同。NNNMMM（八）DNA测序第一代测序双脱氧测序法第二代测序高通量基因组测序第三代测序单分子实时测序（九）甲基化检测甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢钠处理后测序（BSP）（十）反转录PCR(RT-PCR)和Northern印迹杂交三、直接基因诊断的实例（一）杜氏肌营养不良(DMD)XRDMD基因79个外显子60%大片段缺失或重复，其余小片段结构异常或点突变缺失型：多重PCR图然后Gap-PCRMLPA针对每个外显子设计探针，同时进行检测。其余型：PCR扩增外显子后测序RT-PCR间接基因诊断见前述（二）镰状细胞贫血GAG→GTG示图16-8PCR-RFLP，即先PCR再MstII酶切扩增片段。也可不经PCR直接MstII酶切全基因组，用βA、βS探针，行Southern印记杂交。PCR-ASO示图16-9（三）β654地中海贫血突变在内含子中增加剪接位点从而增加一个外显子RT-PCR（四）血友病AXRFVⅢ基因主要点突变或小片段碱基的缺失和插入，基因突变位点多。间接基因诊断见前述（五）脆性X综合征FMR1基因（CGG）nn正常5-50，前突变59-200（未甲基化），全突变200-1000（甲基化）示图16-12双酶切（EcoRI和甲基化敏感酶EagI）Southern印迹杂交五、遗传病诊断的时机临床诊断早期诊断（症状前诊断、产前诊断、着床前诊断）六、产前诊断遗传学检查、生化检查、物理诊

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