圆二色谱原理

1、关于圆二色谱原理第一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月光学活性分子对左、右圆偏光的吸收率的差值第二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月1、自然光光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振现象: 光矢量的振动方向与光的传播方向垂直， 在垂直于光传播方向的平面内, 有不同的振动方向。电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。v0HE第三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月由于感光作用都是E 引起的，因而，将E 作为光矢量。振动面：E 与光传播方向组成的平面。E传播方向振动面第四张，PPT共七十二页，创作于2022年6月从统计规律上说，自然光的光振动: 在垂直于光速的平面上

2、遍布所有方向， 沿各方向振动的光矢量呈对称分布, 相应光矢量的振幅（光强度）相等。第五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月 （1）高亮度的点光源；（2）日光色。色温接近6000K；（3）在可见光区连续光谱；（4）高显色性，显色指数95；（5）在整个寿命期内维持光色特性；（6）高电弧稳定性；（7）热重启能力；（8）启动后即能达到接近最大光输出；（9）电弧光斑小、易聚光。超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。第六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月自然光平面偏振光圆偏振光样品椭圆偏振光第七张，PPT共七十二页，创作于2022年6月双折射现象： 一束光射入各向异性晶体后有两束折射光

3、。 尼科耳棱镜。 2、光的偏振 在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。第八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月名称折射定律折射率传播方向寻常光（o光）遵守对于晶体一切方向都具有相同的折射率在入射面内非常光（e光）不遵守折射率随方向而变化不一定在入射面内第九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光第十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。第

4、十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月自然光平面偏振光起偏器检偏器晶轴相互平行时，透射光强度最大；晶轴相互垂直时，透射光强度为零；晶轴夹角为时，透射光强度与cos2成正比。.第十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月也称线（完全）偏振光，简称偏振光。它的振动面称为其偏振面。振动方向保持不变振幅发生周期性变化E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段3、平面偏振光（Plane polarized light）第十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月4、布儒斯特角当入射光射到两种介质界面上时，反射光和折射光的偏振情况与入射光不同。第十四张，P

5、PT共七十二页，创作于2022年6月5、四分之一波片使o光和e光的光程相差1/4波长的晶片。此时，相位差为/2，透射的合成光是长轴与晶轴重叠的正椭圆偏振光。第十五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月朝光源看， 电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光； 电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。若入射平面偏振光的电矢量与晶体晶轴的夹角45，则Eo = Ee，合成光是圆偏振光（Circular polarized light）。第十六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月6、光的叠加一束自然光可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的平面偏振光的加和。第十七张，PPT共七十二页

6、，创作于2022年6月旋转方向相反的左、右圆偏光透过一光学活性物质后透过的左、右圆偏光振幅相位矢量和相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光，方向改变不等相同椭圆偏振光不等不同椭圆偏振光，方向改变第十八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长的两平面偏振光合成圆偏振光右旋第十九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月7、旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）旋光性：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光虽然仍然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。 旋光物质又称为光学活性物质。旋光度：偏振面旋转的角度

7、 旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。 旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。第二十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月圆双折射：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为nL和nR， 若 nL = nR，则为光学各向同性物质； 若 nL nR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变， 若nLnR，透射光的偏振面右旋。 若nLnR，透射光的偏振面左旋。旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nLnR的结果。第二十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月旋光

8、，双折射第二十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月化合物在正常情况下，处于低能的基态，电子占据所有的成键轨道（、n轨道）。如果电子吸收了外界的能量，它就从基态跃迁到激发态能级。如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线。由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑的曲线。8、光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD）第二十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月光的吸收若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光

9、的光强度小于入射光。第二十四张，PPT共七十二页，创作于2022年6月圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏光变成椭圆偏振光。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。第二十五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系： = 100/（c l） = 3300（ L-R）：介质对圆偏振光的摩尔消光系数， c ：样品摩尔浓度， l ：样品厚度（cm ）， 单位：/（mol cm） 或 cm2/dmol。第二十六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月圆二色性的表示吸收（率）差 = L - R A = AL AR 椭圆度，摩尔椭圆度 = 2.303（

10、AL AR）/4 = 3298（L - R） 3300 （L - R） 在蛋白质研究中，常用平均残基摩尔椭圆度第二十七张，PPT共七十二页，创作于2022年6月园二色双折射第二十八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月9、ORD与CD光谱同时产生，包括同样的分子结构信息：光学活性物质分子中的不对称生色团。CD反映光与分子间能量的交换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。可以由Kronig-Krammers转换方程相互转换。第二十九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月CD谱的极值处与吸收峰一致（科顿效应，cotton effect），因而分子中不同生色团对于谱的贡献比在ORD中更容易分辨

11、。ORD是渐近线，两端不回归ORDCD吸收带附近，旋光度由负到正正Cotton效应正CD带吸收带附近，旋光度由正到负负Cotton效应负CD带第三十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月CD比ORD容易辨别重叠峰CD比ORD弱带易检测CD比ORD更容易拟合CD比ORD提供较多意义明确的信息表明有三个生色团，其中两个有光学活性第三十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月CD能够提供的信息：primary structure, secondary structuretertiary structureAlpha-helix,beta-sheet肽链骨架的构象变化蛋白质的紫外吸收光谱主要有

12、两个峰：190-250nm：肽键280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp第三十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月10、 J-810圆二色光谱仪S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器;M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；第三十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，透射光强度随时间的变化当调制电压过其峰值（正和负）时，RL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）；RL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交

13、流分量所组成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相当于圆二色性透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。第三十四张，PPT共七十二页，创作于2022年6月圆二色光谱仪工作原理用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后的强度IR和IL由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S= IR IL只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG与EA可比）。第三十五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Peltier Cell HolderCD/Total FluorescenceFMOStop

14、ped Flow-20200 第三十六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月The peptide bond is inherently asymmetric and is always optically active蛋白质的光学活性第三十七张，PPT共七十二页，创作于2022年6月1、氨基酸的圆二色性可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。第三十八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月2、肽的圆二色谱活性肽构象与其生理功能的关系肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽

15、的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。第三十九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: -helix, -sheet, -turn, random Tertiary Structure Class: all-, +, /, all-I, all-IINear-UV (320-250nm)： aromatic side chainNear-UV Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins第四十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月苯丙氨酸（ phenylal

16、anine， Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右；色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近；二硫键的变化反映在整个近紫外区。 芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号第四十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Far UV CD spectra of poly-L-Lys1、100% -螺旋2、100% -折叠3、100%无规卷曲第四十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月- band (nm)+ band (nm)-helix 222208192-she

17、et216195-turn220-230 (weak)180-190 (strong)205polypro II helix190210-230 weakRandom coil200212Main CD features of protein 2ndary structures 第四十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月3、估算蛋白质二级结构含量仅适合含量较高的蛋白质！将测得的CD曲线与标准曲线拟合。xa+ xb + xc = 1.0qt = xaqa + xbqb + xcqc改变xa、xb和xc，使qt与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimizati

18、on ）未知结构的蛋白的CD信号第四十四张，PPT共七十二页，创作于2022年6月myoglobin qt = xaqa + xbqb + xcqcfits best with xa = 80% xb = 0%xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coilFor further details: /cd/cdtutorial.htm第四十五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月GCN4-p1 0oC：100% helix75oC：0% helixwhat about 50oC? qt = xoqo + x75q75fits b

19、est with xo = 50% x75= 50%Shows that at 50oC1/2 of peptide a-helix dimer1/2 of peptide random coil monomer第四十六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月 Lau, Taneja and Hodges (1984) J.Biol.Chem. 259:13253-13261螺旋二聚体分解为单螺旋三氟乙醇 （trifluoroethanol，TFE）诱导肽链形成螺旋TFE对卷曲螺旋（coiled-coil）的影响 第四十七张，PPT共七十二页，创作于2022年6月 chymotrypsin

20、(all b) lysozyme (a + b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a)CD signal of a protein depends on its 2ndary structure第四十八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月第四十九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月pH变化引起的肌球素变性前后CD谱的动力学变化第五十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月稀释前后的荧光和CD谱从伸展到折叠螺旋含量的变化的动力学检测Kinetic Trace at 222nm(secondary structure reg

21、ion)Unfolding state (random)Refolding state (-Helix)第五十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Kinetic traces at 289nm (Aromatic side chain region)细胞色素c伸展和折叠状态的CD和荧光光谱反映了芳环侧链（色氨酸残基）的变化盐酸胍中的细胞色素c(伸展状态) 与PBS混合后的CD和荧光光谱第五十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月6、磁圆二色谱（ Magnetic Circular Dichroism ，MCD）磁性材料对左、右圆偏光的吸收不同而产生的二色性现象。利用法拉第效应，在

22、外加磁场的作用下，许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测得CD谱的，在磁场中CD信号可增大几个数量级。7000 Gauss 第五十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月实验要点第五十四张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Sample concentrationA good suggestion is to run in advance an absorption UV-VIS spectra.CD spectroscopy calls for same requirements as UV-VIS: best S/N is obtained with absorban

23、ce level in the range 0.6 to 1.2. Its usually difficult to get proper data when absorbance (of sample + solvent) is over 2 O.D.第五十五张，PPT共七十二页，创作于2022年6月样品杯：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。光程：0.01cm-1cm，为了降低溶剂影响，一般提高样品浓度，用短光程。cell pathlength第五十六张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Nitrogen flushingFlushing the optics with dry

24、 nitrogen is a must:Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrorsbelow 195nm oxygen will absorb radiation第五十七张，PPT共七十二页，创作于2022年6月HT plotThe HT plot is very important, since readings above 600-650V mean that not enough light is reaching the

25、 detector so a sample dilution or the use of shorter path cell are required.the HT plot is in realty a single beam spectra of our sample, since there is a direct relation between HT and sample absorbance. By data manipulation HT conversion into absorbance and buffer baseline subtraction is possible.

26、 Alternatively single beam absorbance scale can be used already in CH2 during data collection, loosing however a bit the alerting functions of this channel.第五十八张，PPT共七十二页，创作于2022年6月第五十九张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Bandwidth (SBW) selectionSetting of slits should be as large as possible (to decrease noise le

27、vel), but compatible to the natural bandwidth (NBW) of the bands to be scanned.As a rule SBW should be kept at least 1/10 of the NBW, otherwise the band will be distorted.If NBW is not known a series of fast survey spectra at different SBW will help proper selection. Trade in of accuracy versus sens

28、itivity (i.e. the use of larger than theoretical SBW) is occasionally required.2 nm in the far UV region1 nm in the aromatic region (where fine structures may be present), optimal band-pass (as large as possible, but not loosing information) can be determined after a trial第六十张，PPT共七十二页，创作于2022年6月标准操

29、作时谱带宽度选为1nm；高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时PMT电压较高，信噪比差；当样品的光密度很高、CD很小时，就要保持测试CD峰多需要的足够浓度，并用较宽的狭缝宽度。此时，由于样品OD值过高，可能存在有荧光或杂散光引起的某些假象。第六十一张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Number of data pointdata pitch, i.e. number of data points per nm, will not directly influence the noise level. However if post run further data processing w

30、ill be applied to reduce the noise, its advisable to collect as many data points as possible to increase the efficiency of the post run filtering algorithm第六十二张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Accumulationanother way to improve S/N is to average more spectra. Here too the S/N will improve with the square root of

31、 the number of accumulations.Averaging is very effective since it compensates short term random noise, but itll not compensate long term drifts (mainly of thermal origin). So if long accumulations are used we recommend a suitable long warm-up of the system and/or the use of a sample alternator (to c

32、ollect sequentially sample and blank and average their subtracted values).For long overnight accumulations its essential that room temperature is well kept stable.第六十三张，PPT共七十二页，创作于2022年6月Buffer Systems for CD AnalysesAcceptable:1. Potassium Phosphate with KF, K2SO4 or (NH4)2SO4 as the salt.2. Hepes, 2mM.3. Ammoniu