大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法EscherichiaColiTestMethod1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。3.责任者QC化验员。4.程序：4.1.简述4.1.1.大肠埃希菌(Escherichiacoli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。4.1.2.用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。4.2.仪器、设备及用具4.2.1.无菌室4.2.2.净化工作台4.2.3.培养箱(36±1℃4.2.4.高压蒸汽灭菌器4.2.5.显微镜(1500X)4.2.6.微波炉4.2.7.恒温水浴（45±1℃4.2.8.离心机(500～4000r/min)4.2.9.0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器4.2.10.电冰箱4.2.11.匀浆仪4.2.12.366nm紫外灯4.2.13.玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1.0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃4.3.2.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。4.3.3.甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。4.3.4.V-P试液α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。4.3.5.革兰染色液4.3.5.1.结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。4.3.5.2.革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。4.3.5.3.脱色液95％乙醇4.3.5.4.沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。4.3.6.亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。4.3.7.溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)4.3.8.酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。4.3.9.曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。4.3.10.无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯801ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃4.3.11.无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃4.3.12.无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃用于细菌检查。薄膜过滤法取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为47mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液(含1％对氨基苯甲酸约1～5ml)中，含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中(表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用)。沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。4.7.检查方法验证在建立供试品的大肠埃希菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证试验按供试液的制备和大肠埃希菌检查法所规定的方法进行。4.7.1.验证方法4.7.1.1.试验组取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接种到增菌培养基中。4.7.1.2.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证大肠埃希菌检查法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。阴性对照菌不得检出。4.7.2.结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和大肠埃希菌检查法进行供试品的大肠埃希菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的大肠埃希菌检查同时进行。4.8.操作步骤4.8.1.检验程序4.8.1.1.4.8.1.2.阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）大肠埃希菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。4.8.2.增菌培养4.8.2.1.取胆盐乳糖(BL)培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18～24小时，必要时可延长48小时)，阴性对照应无菌生长。4.8.2.2.取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时取未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。4.8.3.分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环1～2ml环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。表1大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。为了规范操作，以下是对药典要求的补充。4.8.4.纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。4.8.5.革兰染色、镜检4.8.5.1.以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次(载玻片烫手)固定。4.8.5.2.滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。4.8.5.3.滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水。4.8.5.4.滴加95％乙醇，脱色20～30秒钟，水洗。4.8.5.5.滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。4.8.5.6.染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短埃希菌，或球埃希菌状，亦有埃希菌状。4.8.5.7.注意事项（1）玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。（2）培养物的菌龄以16～24小时为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。（3）脱色是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。（4）可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制。4.9.生化试验4.9.1.乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接中5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。4.9.2.靛基质试验(Ⅰ)取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98％的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24小时即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。4.9.3.甲基红试验(M)取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中加入甲基红指示液2～3数滴(约每ml培养液加指示液1滴)，轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。4.9.4.乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时(通常在30分钟)内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。4.9.5.枸橼酸盐利用试验(C)取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。4.10.结果判定4.10.1.当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。4.10.2.MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为－＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为＋＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。4.10.3.供试品培养物检查不符合4.10.2中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。4.10.4.当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。4.11.注意事项4.11.1.MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、埃希菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出亦判为不合格。4.11.2.配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。4.11.3.培养时间供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h和24h要观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。4.11.4.结果观察取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强的蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管