第五章 愈伤组织培养

第五章愈伤组织的培养第一节愈伤组织的诱导和分化第二节愈伤组织中的形态发生第三节人工种子编辑课件第一节愈伤组织的诱导和分化1愈伤组织的诱导2影响愈伤组织诱导形成的主要因素编辑课件愈伤组织(callus)：离体组织或器官进行离体培养时，进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的无定形的薄壁细胞。FromembryocultureFromroot1愈伤组织的诱导编辑课件编辑课件编辑课件2愈伤组织的形成从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：愈伤组织形成起始期分裂期形成期编辑课件2.1起始期：细胞准备进行分裂的时期。外植体的细胞处在静止状态。一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成,诱导细胞开始分裂。编辑课件起始期细胞内发生的变化激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成增加,诱导细胞开始分裂。每个细胞的蛋白质总增加量可达200%酶活性增强，气体交换增加，如氧气的吸收增加细胞的大小没有多大改变编辑课件2.2分裂期:分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂增生子细胞的过程。脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能编辑课件分裂期外植体的特征:细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。编辑课件外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加，细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生组织状态。

随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。细胞的主要表现:编辑课件2.3形成期：指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。编辑课件细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的鸟巢状结构。细胞的体积相对稳定，不再减少。出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。细胞特点：编辑课件编辑课件

RedWhitecallus

GreencallusYellowcallus根据愈伤色泽划分为：愈伤组织的分类

编辑课件

易碎的愈伤坚硬的愈伤

生根的愈伤

渗出粘性多糖的愈伤

根据愈伤质地划分为：编辑课件文心兰的根〔a〕茎〔b〕叶〔c〕诱导的愈伤组织根据愈伤发生部位：编辑课件胚性愈伤组织外表呈颗粒状、组织结构紧凑、再生力强。非胚性愈伤组织外表粗糙、组织结构疏松。根据愈伤难易程度：胚性愈伤组织容易形成胚状体非胚性愈伤组织诱导率可达100％，胚性愈伤组织诱导率相对较低。编辑课件愈伤组织生长周期愈伤组织生长周期为2－4周。在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。编辑课件第一节愈伤组织的诱导和分化1愈伤组织的诱导2影响愈伤组织诱导形成的主要因素编辑课件〔1〕不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。不同植物种类、同一植物不同器官来源及其生理状况、年龄的外植体的脱分化〔形成愈伤组织〕能力有很大差异。烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。2影响愈伤组织诱导形成的主要因素编辑课件〔2〕培养基种类对愈伤组织诱导的影响。诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。〔3〕外源激素对愈伤组织诱导的影响---重要因素。〔4〕培养条件对愈伤组织诱导的影响:湿度条件、温度条件、光照条件。编辑课件2,4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响处理（2,4-D:BA）愈伤组织形成情况0:0仅有，不生长0:0.1有限的生长，显绿色0：0.2生长不良0.05:0大块、绿色，平均直径为10mm0.05:1生长不良，稍带褐色0.05:2生长不良，稍带褐色0.1:0大块，绿色至浅褐色0.1:0.1大块，绿色至浅褐色0.1:0.2稍小于0.1:0.1比例，变褐编辑课件各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应〔各种生长素浓度为10μmol/L〕生长素愈伤组织形成种子下胚轴果皮IBA无愈伤组织形成愈伤组织增殖强IBA浓度为1μmol/L时愈伤组织生长良好NAA无愈伤组织形成所有外植体均产生愈伤组织愈伤组织增殖强2,4-D所有外植体均产生愈伤组织2,4-D浓度为1μmol/L时愈伤组织生长良好愈伤组织增殖强NOA萘氧乙酸无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖中等NOP萘氧丙酸无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖强愈伤组织增殖强编辑课件编辑课件第五章愈伤组织的培养第一节愈伤组织的诱导和分化第二节愈伤组织中的形态发生第三节人工种子编辑课件1愈伤组织形态发生方式愈伤组织器官发生通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株第二节愈伤组织中的形态发生编辑课件2愈伤组织器官发生

先不定芽，在茎基部长根先长根后长芽在不同部位分别形成根和芽

编辑课件编辑课件无机盐混合物类营养条件有机物类植物激素类天然复合物类外因渗透压酸碱度影响因子环境条件湿度温度光照内因遗传性生理状态

影响愈伤组织器官发生的因素：

植物激素的作用

外植体自身因素编辑课件〔1〕外植体自身因素〔内因〕

①母体植株的遗传根底被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功报道最多；无性繁殖植物比有性繁殖植物的容易；同种植物不同品种〔基因型〕的培养效果不同编辑课件②外植体的类型影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源于生长活泼或生长潜力大的组织和器官的细胞容易培养。

编辑课件例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层>中层>内层编辑课件编辑课件

高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；适中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生长素细胞分裂素＝适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。〔2〕植物激素的作用〔外因〕编辑课件芦荟的植物组织培养过程1234567891011编辑课件芽〔单芽、丛芽〕编辑课件1愈伤组织形态发生方式愈伤组织器官发生通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株第二节愈伤组织中的形态发生编辑课件3.1胚状体/体细胞胚〔embryoid〕：指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。经过：球形胚－心形胚－鱼雷形胚－成熟胚3体细胞胚发生途径编辑课件DevelopmentoftheArabidopsisEmbryo编辑课件

石龙芮胚状体发生的过程

编辑课件香蕉心形体细胞胚玫瑰心形体细胞胚编辑课件编辑课件3.2体细胞胚的产生方式1〕直接在器官上发生2〕悬浮培养细胞发生途径3〕愈伤组织发生途径:幼胚、胚和子叶4〕单细胞发生途径：花药培养中的小孢子发育成4〕原生质体发生途径胚性愈伤组织编辑课件1〕生长素2〕其他植物生长物质的作用3〕氨源形态的影响4〕其他培养条件对胚状体发生的影响3.3体细胞胚状体诱导的影响因素编辑课件3.4体细胞胚状体诱导的影响因素1〕生长素形成体细胞胚的关键是除去或降低培养基中的生长素成分〔如2,4-D〕。愈伤组织在生长素0.5～1mg/L的培养基上分化形成分生细胞团〔称胚性细胞团〕；转移到生长素含量很低或没有生长素的培养基上，就能发育为胚状体。编辑课件原因：2,4-D等生长素可以诱导内源乙烯〔Eth〕产生；内源Eth不影响愈伤增殖，但抑制愈伤组织进一步分化成胚。乙烯也会导致纤维素酶或〔和〕果胶酶活性的增强，从而破坏胚性细胞团，使原胚不能发生组织分化。编辑课件2〕其他植物生长物质的作用细胞分裂素有利于胚状体的形成0.1μg·L-1玉米素促进胡萝卜体细胞胚发生。GA3、ABA抑制成胚；编辑课件3〕氨源形态的影响复原N〔NH4+〕氧化N〔NO3-〕有机氮〔氨基酸、水解酪蛋白等〕野生胡萝卜叶柄节段的培养中，只有在含一定数量复原态氮的培养基时，才能有胚胎发生，用NH4+和水解酪蛋白优于NO3-或谷氨酰胺。编辑课件4〕其他培养条件对胚状体发生的影响液体培养适宜pH5-6光照：不需要光或半天光照时间温度25℃左右编辑课件光照强度50-60µEm2s-1光照强度5-10µEm2s-1(图光对大豆不同品种子叶体细胞胚发生的影响)编辑课件3.4体细胞胚途径再生植物的优点1〕数量比不定芽多2〕获得速度快3〕结构完整4〕胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；5〕胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。编辑课件第五章愈伤组织的培养第一节愈伤组织的诱导和分化第二节愈伤组织中的形态发生第三节人工种子编辑课件人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。

胚状体或芽：有生命的物质结构。人工胚乳：供胚状体维持生命力。人工种皮：保护作用。1定义与结构

第三节人工种子编辑课件1〕结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；2〕不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；人工种子的优点:3)有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；4)参加抗生素、农药、菌肥等成分，提高人工种子活力和品质；5)由无性繁殖体系产生胚，固定杂种优势。编辑课件2制作人工种子制作过程胚状体人工胚乳其他物质人工种皮包埋技术编辑课件第一步胚状体诱导1〕选取目标植物2〕诱导愈伤组织3〕愈伤组织增生4〕胚状体诱导编辑课件胚状体同步增殖：DNA合成抑制剂低温处理调节渗透压别离过筛调节植物激素配比编辑课件第二步人工胚乳制作人工胚乳的成分无机盐混合物碳水化合物：淀粉和糖蛋白质各种附加成分：如固氮细菌、杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物激素等编辑课件第三步人工种皮制作1〕包埋介质的选择：无毒、透气、保水性好有足够硬度〔不胀大〕，保证平安〔不泄露营养物〕包埋材料：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、明胶、淀粉、动物胶、角叉胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、果胶、蛋白胶、黄芪胶等种类。编辑课件