蛋白质工程课件

绪论

内容

（1）蛋白质化学（2）蛋白质工程2．基本要求

知道蛋白质的概念，了解蛋白质的生物学功能；掌握蛋白质工程的概念；蛋白质工程与基因工程的联系和区别绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别Protein:G.J.Mulder在1838年首次提出。蛋白质是细胞原生质的主要组成成分，其与核酸一起共同构成了生命的物质基础概念：蛋白质是由20种a-氨基酸组成的高分子有机物质,在体内执行多种生理功能蛋白质化学一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学一、蛋白质的元素组成

CHONS（50%）（7%）（23%）（16%）

（0～3%）Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I磷铜铁锌锰钴硒碘

蛋白质氮元素的含量都相当接近，一般在15%—17％，平均为16％。这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础

6.25

—16％的倒数，每测定１g氮相当于6.25g的蛋白质。也就是1g氮所代表的蛋白质量（克数）蛋白质含量＝蛋白氮×6.25一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学蛋白质的分类

(Classificationofproteins)

(一).依分子形状分类(Classifiedaccordingtoshape)球状蛋白质：血红蛋白、血清球蛋白等纤维状蛋白质：胶蛋白、丝蛋白等(二).依蛋白质组成（Classifiedaccordingtocomposition）简单蛋白质：水解为α-氨基酸结合蛋白质：单纯蛋白质+辅基如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白等(三).依蛋白质溶解度（Classifiedaccordingtosolubility）清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白(四).依蛋白质功能（Classifiedaccordingtofunction）活性蛋白质非活性蛋白质一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学蛋白质的大小与分子量蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000—1000000道尔顿（Da）或更大某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万道尔顿分子量>6000时，有完整的生物学功能，至少40个aa。分子量<6000时，不完全有生物学功能。一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学

蛋白质的生物功能

Proteinshavemanydifferent

biologicalfunctions

1).酶的催化功能(Enzymaticcatalysis)Firefliesemitlightcatalyzedbyluciferase(荧光素酶)withATP2).运输和储存功能TransportandstorageErythrocytes（红细胞）

containalargeamountofhemoglobins（血红蛋白）,theoxygen-transportingprotein.3).机械功能(Mechanicalfunctions)Theproteinkeratin（角蛋白）

isthechiefstructuralcomponentsofhair,scales,horn,wool,nailsandfeathers.4).运动功能(Movement)striatedskeletalmusclecell5).保护功能(Protection)6).信息传递功能

(Informationprocessing)SimpleAnatomyoftheRetina★蛋白质的生物学意义蛋白质是一切生物细胞和组织的主要组成部分，是生命活动所依据的物质基础2.生物的各种生物功能也都靠蛋白质体现。如细胞结构、生物催化、物质传输、运动、防御、调控以及记忆、识别等方面小结蛋白质化学的研究成果1）发现了数千种不同功能和来源的蛋白质2）其中有上千种蛋白质的氨基酸排列顺序已被测定出来3）上百种已获得高分辨的分子结构解析图这些成就,特别是蛋白质结构与功能的特殊联系方面的成就,为改造蛋白质奠定了关键的基础绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程诞生：1982年，Winter通过基因定位右边得到了改性的酪氨酸tRNA合成酶1983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志主要内容：1）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系

基本目的：1）实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能2）设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质

蛋白质工程定义：

以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质蛋白质工程绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程操作流程纯化蛋白质合成寡核苷酸晶体结构模型蛋白质结构功能研究基因文库克隆化基因计算机辅助设计M13克隆分子性质及分子定向改造方案DAN序列分子测试性质表达载体纯化突变型蛋白质突变体1、分离纯化0.1-1.0mg纯蛋白质2、测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针3、以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体M13系统，用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析4、通过表达载体获得较大量(0.1-1.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案5、通过寡核苷酸M13系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子

绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

主要研究方向1、蛋白质结构分析（研究核心）

1）收集大量的蛋白质分子结构的信息

2）建立结构与功能之间关系的数据

3）蛋白质结构与功能之间关系的理论研究三维空间结构的测定是证明新结构改变了原有生物功能的必需手段蛋白质工程主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射线衍射照片J.Bernal,D.Crowfoot1957年，肌红蛋白晶体结构Kendrew1956年，维生素B12晶体结构

D.C.Hodhkin1959年，血红蛋白晶体结构Perutz蛋白质结构分析主要技术：晶体学技术（x射线晶体结构分析）：1.对原材料的要求：具有高度的均一性；影响因素有金属离子、辅酶或一些成键的辅助集团的变化或缺失；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的聚合效应等2.晶体生长的生化条件：pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓度等因素缺陷需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克-几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析蛋白质结构分析主要技术：多维核磁共振波谱技术：二维同核核磁共振方法：对氢原子核的二维核磁共振信号进行分析，主要用于β类蛋白质多维异核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白质和α螺旋的多肽优点：样品要求低（蛋白质可溶性、高稳定性、高丰度）；

分析液态下的肽链结构。已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。可以更有效地分析蛋白质的突变缺点：仅限于分子量较小的蛋白质蛋白质结构分析研究现状蛋白质空间结构的测定已经成为生命科学的“瓶颈”美国NIH投资1.25亿美元，计划测定1万个蛋白质晶体结构；日本RIKEN将建16台高分辨率核磁共振仪，用来测定小分子蛋白质结构技术上的障碍：在克隆、表达、纯化和结晶过程中，大约20个蛋白质中能得到1个可供结构测定的晶体，并且一些蛋白质（膜蛋白）根本不可能被结晶现阶段主要研究手段根据氨基酸序列从理论上计算其相应空间结构成为蛋白质领域内科学家们的奋斗目标蛋白质结构分析主要研究方向：1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

蛋白质工程2、结构预测

1）对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能2）根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构

蛋白质工程蛋白质结构预测1、理论分析方法或从头算方法(Abinitio)：该类方法假设折叠后的蛋白质取能量最低的构象2、统计方法：对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。这一类方法包括经验性方法、结构规律提取方法、同源模型化方法等

主要技术：分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能研究现状：尚在起步阶段

蛋白质结构预测主要研究方向：1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

蛋白质工程创造和改造蛋白质：1）物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等2）生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等缺点：缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用3）基因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质蛋白质工程

修饰目标明确在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究蛋白质工程基因工程技术在蛋白质工程中的应用

定点突变：改变其中的一个或两个三联密码就可以改变氨基酸盒式突变：1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析

PCR技术：直接、快速和高效

高突变率技术：①硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因②UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制

蛋白质融合：将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等

绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库

F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质数据库1、核酸序列数据库EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory)http://www.ebi.ac.uk/embl/GenBank/GenBank蛋白质数据库2、蛋白质序列数据库由瑞士SwissInstituteofBioinformatics

和

EuropeanBioinformaticsInstitute合建

/蛋白质数据库3、蛋白质结构数据库（PDB）由美国BrookhavenNationalLaboratory开发4、蛋白质二级结构数据库（DSSP）WolfgangKabschandChirsSander设计http://www.sander.ebi.ac.uk/dsspftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dssp绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程的成果1.基础研究方面:

酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP存在的条件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸转移到tRNA的3'末端形成酪氨酰tRNA蛋白质工程的成果2.实际应用方面:

到目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种

诱变蛋白质氨基酸突变原定目标结果

T4溶菌酶Ilu→Cys构建二硫键成功增加热稳定性

枯草杆菌Gly→Lys拓宽酶作用的成功蛋白酶底物范围

Ala→Leu提高抗氧化性能

α-抗凝酶Met→Val提高抗氧化性能成功胰蛋白酶Gly→Ala提高酶水解专一性成功

β-内酰胺酶Ser→Cys验证Ser对该酶成功的重要性

β-干扰素Cys→Ser提高稳定性成功

白细胞介素-2Cys→Ser提高产物活性

不成功二氢叶酸Asp→Asn验证酶的活性成功中心还原酶

蛋白质工程在医学上的应用1）提高蛋白质的稳定性如葡萄糖异构酶（GI）突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10-12℃；酶比活相同2）融合蛋白质

化学合成的脑啡肽EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人α1型干扰素IFN基因连接，在大肠杆菌中表达这一融合蛋白，融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN3）蛋白质活性的改变将胰岛素B链改为B28Lys－B29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。4）治癌酶的改造5）嵌合抗体和人缘化抗体

嵌合抗体就是用人抗体的恒定区替代鼠单克隆抗体的恒定区，这样它的免疫原性就显著下降

人缘化抗体就是将抗原吸附区域嫁接到人抗体上，这样抗体上的外源肽链降低到最小，免疫原性也就最小。人缘化抗体如治疗脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反应可以忽略不计蛋白质工程在农业方面的应用

饲料用酶的分子改良与产品研制饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制重要农作物蛋白质标记的分离鉴定食品用酶及抗氧化酶的分子改良与产品研制有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制重大动物疫病快速检测试剂的研发

饲料用酶的分子改良与产品研制

针对饲料用酶的特殊要求,重点开展最具应用价值和市场急需的木聚糖酶、b-葡聚糖酶、a-半乳糖苷酶、b-甘露聚糖酶、角蛋白酶等饲料用酶的分子改良和产品研制,获得同时具有高比活、耐高温、pH作用范围广、抗胃肠道蛋白酶等高性能的改良酶,构建高效表达工程菌,建立高效发酵生产工艺技术及相关技术标准,实现产业化生产

饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制

针对饲料用抗菌肽的特点和要求，应用蛋白质工程分子设计技术和高效表达技术，开展防御素、Cathelicidin等抗菌肽的分子改良和产品研制，获得对主要饲料有害真菌和细菌均有高效杀灭作用的广谱抗菌肽，构建高效表达工程菌，建立高密度发酵技术和产品后加工技术，并确立饲料用抗菌肽的产品标准和应用技术规范，实现产业化生产

重要农作物蛋白质标记的分离鉴定

建立分离鉴定重要农作物的蛋白质标记的技术体系，形成一批具有自主知识产权的蛋白质标记,为我国重要农作物的分子育种与分子改良提供重要的技术支撑

食品用酶及抗氧化酶的

分子改良与产品研制

重点开展乳糖酶、超氧化物歧化酶、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶、弹性蛋白酶的产品研制。通过分子改良获得具有高比活、耐高温和耐酸碱等优良综合特性的改良酶。构建高效表达工程菌，完善酶制剂的高效发酵及后加工技术，实现产业化生产有机磷降解酶及毒素解毒酶

的分子改良与产品研制通过蛋白质分子改良和修饰技术，改造拥有自主知识产权的有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶，获得同时具有催化活性高、pH作用范围宽和广谱降解能力的改良酶，构建高效表达工程菌,完善高效发酵和后加工技术,建立酶的应用技术体系，实现产业化生产重大动物疫病快速检测试剂的研发

利用核酸体外扩增技术、基因工程技术、蛋白质工程技术以及单克隆抗体技术，设计表达和大量生产重大动物疫病病原微生物（禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、蓝耳病病毒等）的主要抗原性蛋白及这些抗原性蛋白的特异性单克隆抗体，建立上述蛋白的高密度培养、大规模纯化和质量控制技术。同时利用免疫扩散技术、胶体金标记技术及仿细胞膜模型建立体外蛋白识别体系，开发适用于野外和现场检测的新型胶体金快速检测试纸等生物传感器，为动物重大疫病及人畜共患传染病的抗原检测和抗体水平评价提供实时、高效的监测技术手段和产品蛋白质工程存在的问题1.构象的快速测定手段:

以分子定向改造为目标的蛋白质工程须借助于精确的三维结构信息,而目前主要靠X-射线单晶体结构分析,受到单晶培养的限制。目前正在寻求通过电子衍射三维分析、二维核磁共振等手段来克服上述限制蛋白质工程存在的问题2.基因高效表达以及有效的下游技术寻找高效表达载体、分泌性寄生系统以及各种高效批量分离技术是克服这一限制的关键绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别基因工程

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程基因工程基本用途1、分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源2、大规模生产生物活性物质3、设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要基因工程的基本形式第一代

蛋白多肽基因的高效表达

经典基因工程第二代

蛋白编码基因的定向诱变

蛋白质工程第三代

代谢信息途径的修饰重构

途径工程第四代

基因组或染色体的转移

基因组工程绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别大规模生产生物活性物质分离工程野生型细胞基因工程蛋白质工程途径工程工程细胞发酵工程细胞工程酶分离工程酶工程野生型细胞生物活性物质蛋白质工程和基因工程联系：以基因工程技术为依托，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域，被誉为第二代遗传工程区别：蛋白质工程可以改造现有蛋白质和制造新型蛋白质，基因工程原则上只生产自然界已存在的蛋白质蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推作业：名词解释：蛋白质工程简答蛋白质工程的主要研究内容与目的蛋白质工程与基因工程的联系与区别

蛋白质的修饰和表达蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的分子生物学途径氨基的化学修饰三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α-氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基。羧基的化学修饰由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行氧化和还原反应二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。化学修饰影响的条件1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。3、温度：影响活性巯基的微环境4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。化学方法：

产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合非共价缔合产生二硫键形成肽键产生非天然型的共价键非共价缔合在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物产生二硫键二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开

DTT、二硫苏糖醇将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子形成肽键通过酶连接反应形成肽键从猪胰岛素生产人胰岛素将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）

通过酶法与活性酯偶联羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子产生非天然型共价键利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体如：抗体制备具有不同功能的F（ab)2的类似物蛋白质改造的分子生物学方法突变：寡核苷酸介导的定向突变、

PCR方法、盒式突变定向进化：异错PCR、基因家族改组技术表达体系原核表达：大肠杆菌真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞

二、蛋白质改造的分子生物学途径定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断优点：突变率高、简单易行、重复性好应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理方面研究应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导的定点突变及盒式突变随机突变优点：在体外模拟自然进化的过程常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNAfamilyshuffling)等

寡核苷酸引物介导的定点突变1、将待突变基因克隆到突变载体上2、制备含突变基因的单链模板;3、引物与模板退火，以5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA,4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口,产生闭环的异源双链的DNA分子;5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选6、对突变基因序列进行分析寡核苷酸引物介导的定点突变的改进缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体

2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的步骤

3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’P模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株ung-dUTP酶缺陷突变体dut-

转染ung+模板链降解Kunkel方法寡核苷酸引物介导的定点突变的改进关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板宿主：E.coliCJ236品系基于抗生素抗性“回复”的突变方法多克隆位点TetrAmpsTetrAmps突变氨苄青霉素抗性的阳性克隆设计突变体引物氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸PCR方法介导的定点突变通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的取代突变、插入突变、缺失突变5’3’5’3’5’3’5’3’盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因中的相应序列，设计成粘性末端步骤：1、将克隆片断用限制性内切酶切割2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片断混合3、产生突变基因产物限制性内切酶目标基因中要有适当的限制性内切酶位点：利用遗传密码简并性确保盒式突变序列的正确插入方向3种方法优缺点比较1、寡核苷酸引物介导的定点突变法

优点：保真度比PCR突变法高，改进后的突变成功率大大提高缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶切位点限制2、PCR方法优点：操作简单，突变成功功率达100%。缺点：后续工作复杂，要与载体相连；TaqDNA聚合酶保真性低，要分析学列3、盒式突变优点：简单、突变效率高缺点：合成多条引物的成本较高蛋白质定向进化1993年，美国科学家ArnoldFh首先提出酶分子的定向进化的概念易错PCR技术为代表的无性进化DNAshuffling为代表的有性进化定向进化技术人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本蛋白质（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化蛋白质定向进化的原理随机突变的策略易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术易错PCR易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变DNA改组和外显子改组DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR(sexualPCR)，原理如图所示

外显子改组(exonshuffling类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。体外随机引发重组

体外随机引发重组(randompriminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度交错延伸定向进化的筛选策略琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选流式细胞计数法细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定突变体分离通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测酶检测信号探测分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁定向进化与自然进化的异同点定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：进化动力不同：保守突变非保守取代；进化方向不同：适应突变的积累；进化速度不同：非常漫长只需几年、甚至几天；

进化目标不同：适应环境超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。定向进化技术Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌定向进化的应用改进的易错PCR方法：MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对；加入0.5mmol/LMnCl2降低聚合酶的特异性；dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入；TaqDNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。Figure1Theroutineofstaggerextensionprocess结果产生间隔含不同模板序列的新生DNA分子Figure11Strategyoftheconstructionoftherecombinant

Figure12Strategyofselectionoftherecombinantplasmid基因融合避免外源蛋白的快速降解：小肽使表达产物快速、有效的回收和纯化：分泌-亲和融合、双亲和融合法、分泌-插入融合法定向分泌：信号肽体外切割：改变外源蛋白的溶解性，防止包涵体的形成：与硫氧化还原蛋白形成融合体研究蛋白质结构功能融合基因的构建的方法PCR方法蛋白质内含肽接到的蛋白质分子的连接目标蛋白或蛋白片段用pCYB作为表达载体进行连接，产生目标蛋白-蛋白内含肽-甲壳素结合蛋白结构域的融合蛋白。此蛋白与苯硫酚及合成肽一起融合，形成融合肽载体为pCYB载体为pCYB载体为pCYB，形成蛋白内含子-甲壳素结合蛋白结构域的融合蛋白tRNA接到的非天然氨基酸掺入4.1将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中4.2利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定氨基酸的密码子突变为无义密码（TAG）4.3利用runoff转录或化学/酶法反密码子环取代法合成相应的校正tRNA，将氨基酸连接在校正tRNA上4.4通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAG的mRNA，4.5通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋白质分子中的特定位点外源蛋白表达体系原核表达体系：大肠杆菌真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物原核表达体系是外源基因表达的首选体系，只有在大肠杆菌中的表达产物由于不能正确折叠或缺少翻译后修饰而没有生物活性，或当天然蛋白质的回收率太低时，才考虑选择其它表达体系。优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，高密度发酵；缺点：①没有真核转录后加工的功能②没有真核翻译后加工的功能③表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体如何改善外源蛋白的溶解性？外源蛋白的分泌表达细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度（降低到30度或更低）；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用部分诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可溶蛋白积累。外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、His6标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性。酵母表达体系表达载体：Yep（酵母附加体质粒）和YCp（酵母着丝点质粒），二者都含有促进在酵母中自主复制的序列，或ARS序列元件。是多拷贝质粒甲醇酵母系统外源蛋白质在酵母细胞中可以在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成正确的二硫键。在酵母细胞中可以产生N-和O-连接的糖基化，从而糖组分与蛋白质分子共价相连。哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性表达载体的表达①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自pBR322的衍生质粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列；②启动子和增强子；③剪接信号；④终止信号和poIyA加尾信号遗传选择标记：胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加宿主细胞常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等CHO细胞则利于外源基因的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生产，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%

降低外源多肽降解的策略用蛋白酶缺失的菌株作为受体菌；形成融合体；改变生长条件：饥饿时可引起蛋白质周转率提高，低温降低蛋白水解，酸性条件抑制外泌蛋白降解（Ph5.5-6）。

蛋白质的修饰和表达第一节蛋白质修饰的化学途径一、功能基团的特异性修饰

I.

多位点取代

II.单一的限制性取代

III.次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰I.嵌合蛋白质—非共价缔合系统

II.二硫键与嵌合蛋白质的形成

III.嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键

IV.嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键

V.通过非肽键形成嵌合蛋白质

一、功能基团的特异性修饰在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。一、功能基团的特异性修饰1．多位点取代2．单一的或限制性取代

3．次级取代

1．多位点取代(1)常规的氨基保护

(2)亚氨代乙酰基

(3)其他的侧链取代

2．限制性取代

(1)

-异硫氰酸苯酯对

-氨基的选择性(2)羰基二酰肼的亲核取代(3)蛋白醛(4)通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的

-酰胺(5)蛋白醛—由糖的化学氧化产生

3．次级取代(1)与蛋白醛偶联—亲核取代物

(2)与蛋白质活性亲核物偶联—醛取代物

二、基于蛋白质片段的嵌合修饰

通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共价键，可以将较小的肽段连在一起，这就是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原则。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰1．通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质2．二硫键与嵌合蛋白质的形成3．嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键4．融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键5．通过非肽键形成嵌合蛋白质

第二节蛋白质改造的分子生物学途径一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.

编码基因的专一性位点突变

2.

区域性定向突变

二、基因融合和基因剪接1.

利用基因融合技术表达外源基因的缘由

2.

基因融合的策略

3.

产生蛋白质分子嵌合体的方法

4.

蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接

三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。可以这样说，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。

1．编码基因的专一性位点突变

专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。

(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素

(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法

①Kunkel突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变④利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变2．区域性定向突变

基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassettemutagenesis)，又称片段取代法(DNAfragmentreplacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。研究目的

通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。二、基因融合和基因剪接1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由2．基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接基因融合的用途

上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。

第三节重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达

一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。大肠杆菌表达体系的应用

当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。1．表达载体的一般特点(1)复制起始点(2)选择性基因(3)强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列(5)核糖体结合位点(6)合适的多克隆位点2．与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始(2)有效的翻译(3)蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌3．改善表达水平的方法①诱导条件②外源基因的编码序列③用蛋白酶缺失的宿主菌4.改善外源蛋白溶解性的方法①外源蛋白的分泌表达②细菌生长温度③外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达④外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达

4.

翻译后修饰二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达

1.有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

2.

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达4.

外源蛋白质的翻译后修饰

三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达

1．选择哺乳动物细胞表达体系的优点2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统1．哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。分泌型哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处

是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。其他表达系统原核表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统还有昆虫表达系统卵母细胞表达系统转录一翻译偶联的无细胞表达系统这些系统可根据具体需要来选择使用。

四、噬菌体显示(Phagedisplay)关于噬菌体显示的表达载体噬菌体显示技术的操作噬菌体显示技术的应用

蛋白质分子设计第一节:基于蛋白质天然结构的分子设计第二节:全新蛋白质分子设计

第三节:计算蛋白质分子设计

蛋白质分子设计蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质分子设计方面的主要内容与研究进展，以及应用分子设计取得的成功实例。蛋白质分子的特殊性蛋白质分子功能的重要性蛋白质分子应用的局限性蛋白质分子结构的脆弱性蛋白质工程与蛋白质设计蛋白质设计及结构与功能关系研究的必要性;蛋白质设计是多学科的交叉领域;蛋白质设计在许多方面取得的显著进展Proteinengineering:bywhichwemeanmutatingthegeneofanexistingproteininanattempttoalteritsfunctioninapredictablewayProteinDesign:whichhasthemoreambitiousgoalofdesigningdenovoaproteintofulfilladesiredfunction第一节基于天然蛋白质结构的分子设计

一、概述蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的，蛋白质的结构涉及一级结构(序列)及三维结构。即使蛋白质的三维结构是已知的，选择一个合适的突变体仍是困难的，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。

计算机模拟

基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选。由于真菌与细胞相对容易处理，因此它们是一个生物活性物质源。由于基因工程的发展，真核基因表达技术的发展使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长，又增加了新的生物活性物质源。蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面

筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。蛋白质三维结构知识的必要性

蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(ProteinDataBank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。设计目标及解决办法

蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。

设计目标

解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥增加内氢键数目改善内疏水堆积增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换内离子对的置换专一性的改变增加逆转数(turnovernumber)改变酸碱度蛋白质设计的目标及解决办法二、蛋白质设计原理

①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。④疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。⑤在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。⑥对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。⑦最优的氨基酸侧链几何排列。⑧结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。实践表明这是蛋白质设计最困难的问题。三、蛋白质设计中的结构－功能关系研究蛋白质结构－功能关系的重要性定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用

1.根据结构信息确定残基的突变：酪氨酰t-RNA合成酶

2.其他实验方法鉴定功能残基：HIV-1蛋白酶；GM-CSF；

3.利用蛋白质同源性鉴定功能残基：保守残基构象的探测定位突变种类插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。突变的加和性原则突变蛋白质结构的评估溶解性热力学分析Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱园二色散方法单克隆抗体探测构象变化结构与功能的容忍度

蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23％的突变体保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构。四.天然蛋白质的剪裁分子剪裁：替换蛋白质分子的一个肽段，或一个结构域1）抗体工程（ChapterVI）2）Rop第二节全新蛋白质设计特征：全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列。蛋白质的全新设计内容蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计取得的进展：血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。一、蛋白质结构的从头设计二级结构模块单元的自组装配体诱导组装通过共价交叉连接实现肽的自组装：-S-S-；DAB在合成模板上的肽自组装线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计

二、蛋白质功能的全新设计

蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化。为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质。蛋白质的功能设计１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能２．键合及催化的从头设计３．在全新蛋白质中引入结合位点４．催化活性蛋白质的设计５．膜蛋白及离子通道的设计６．新材料的设计第三节计算蛋白质设计蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展。计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类(内核、表面、边界)、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容。二、蛋白质的功能设计1）通过反向Mimicking天然蛋白质设计新功能2）键合及催化的从头设计3）在全新蛋白质中引入结合位点4）催化活性蛋白质的设计5）膜蛋白及离子通道的设计6）新材料的设计IntroductiontoStructuralBiology:

prediction,engineering,anddesignofproteinstructuresProteinscanbemademorestablebyengineeringThefactorsthatareimportanttoproteinstabilitycanberevealedbydoingproteinengineeringstudies.Anexample:T4lysozyme(fromtheworkdonebyBrianMathews,Univ.ofOregon).T4lysozyme(a)Isa164-aapolypeptidechainthatfoldsintotwodomains:TheN-terminaldomainisof+type,andtheC-terminaldomaincomprises7shorthelices.(b)Hasnodisulfidebonds(c)HastwoCysresidues,Cys54andCys97(thatarefarapartinthefoldedstructure)T4lysozyme(contd.)Tm(themeltingtemperature)Tm(themeltingtemperature):thetemperatureatwhich50%oftheenzymeisinactivated(ormorerigorously,50%oftheenzymeisunfolded)duringreversibleheatdenaturation.ThehigherTm,themorestabletheprotein.WTT4lysozyme’sTm:41.9°CThermodynamicparametersobtainedfromDSCmeasurementsDSC:DifferentialScanningCalorimetry差示扫描量热法DeterminationofHandSfromDSCCpTThermaldenaturationofaproteinThreemethodstoengineeramorethermostableproteinthanwildtypeT4lysozyme(1)reducingthedifferenceinentropybetweenfolded