植物病毒病的检验与鉴定课件

植物病毒病的诊断与鉴定晶植物病毒病的诊断与鉴定植物病毒病：是由植物病毒寄生引起的病害植物病毒病的危害及作用1.病毒引起的病害在数量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫芦科等。在辽宁省引起消灭性的植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，辣椒花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。2.生产上危害较大的植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。3。植物病毒也有可利用的价值，特别在开发基因工程的载体、转基因植物研究等方面，发挥了很大的作用。植物病毒病的诊断与鉴定植物病毒简介植物病毒病的病症特点植物病毒病的鉴定方法植物病毒病的防治一、植物病毒病简介观察需要电子显微镜植物病毒主要成分是核酸和蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类。核酸5--40%，蛋白质60-95%。植物病毒类型多样，结构特异植物病毒主要类型1.长而弯曲的线状粒体2.僵直的杆状粒体3.示杆状或线状病毒核酸与蛋白亚基的排列4.杆菌状粒体5.杆菌状粒体横切面6.多角体病毒粒体7.二十面体的核酸与蛋白亚基的排列二、植物病毒病的病症特点一、外部病症(Symptom)：病毒病害在病症表现上多为系统发病，表现为变色、畸形，少数引起坏死、腐烂，萎蔫极少发生。变色：花叶，黄化。坏死：也称作枯斑反响，如马铃薯Ｙ病毒的某些株系侵染烟草可产生脉坏死。畸形：抑制型：矮化，卷叶，皱叶，蕨叶。刺激型：丛生，肿瘤。花叶〔变色界限明显〕山茶花叶病黄化〔叶柄发黄〕坏死：以植物的组织和细胞死亡为特征，表现为枯斑、腐烂、焦枯等。叶片卷曲大丽花病毒病皱叶病苹果皱叶病蕨叶病毒病；即叶片先从心部开始变硬呈带状或丝状扭曲，严重者仅有一粗条叶脉，不能正常开花。马铃薯瘤肿病肿瘤：主要为病害植株地下局部，薯块和匍匐茎上发生普遍。被害块茎的芽眼和匍匐茎，由于病菌刺激细胞不断分裂，形成大小不一、形状不定、粗糙突起的肿瘤二、

病组织的内部和细胞的变化：

1.组织变化：

组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引起薄壁组织坏死，有些引起茎部维管束和叶部坏死，烟草花叶病毒侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。一般引起黄化类型的病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。组织坏死

组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生激素，引起增生。病组织的薄壁细胞分裂加快，数量迅速增多，使局部组织出现肿瘤或癌肿.有时植物细小的不定芽或不定根大量萌发生成丛枝或发根，也是增生的结果。组织增生2.细胞的变化：

花叶和斑驳是由于细胞内叶绿素遭到破坏所致。

内含体：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下可以观察到。

内含体的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作为一种诊断的指标。②但并不是所有的病毒病都有内含体，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体，因此，单靠内含体诊断还有一定的局限性。

内含体甜椒表皮组织显微镜照片，经紫红核酸染剂染色，可看到中空的晶体状内含体可在细胞内看到晶体内含体(箭头)。N:细胞核，S:气孔。三、患病植物的生理变化：表现为：①病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在叶部积累引起黄化。④多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性增强，使细胞中毒坏死。⑤光合作用下降，破坏了寄主的叶绿素。⑥植物内源激素水平失去平衡，造成畸形植物病毒病的病症特点三、植物病毒病的鉴定方法〔一〕传统生物学鉴定方法目测法:利用病毒在植株上表现出来的外部特征进行鉴定根据病毒的传播方式可以确定病毒的属。病毒的媒介传播是确定病毒的辅助方法。指示植物鉴别法：利用将病毒接种在指示植物上表现出的特征性状，作为鉴定是否感染病毒〔二〕物理特征鉴别法1.稀释限点(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀释度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度的上下。2.钝化温度(ThermalInactivationPoint,TIP)处理十分钟使病毒丧失活性的最低温用摄氏温度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有45℃；最高的是烟草花叶病毒，为97℃；而大多数植物病毒在55—70℃之间；3.体外存活期(Longevityinvitro，LIV)在室温(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最长时间。大多数病毒的存活期在数天到数月。4．沉降系数及分子量沉降系数的测定要用超速分析离心机，根据该病毒在一定离心力下沉降的速度来计算。有了沉降系数还可以来计算分子量。5．光谱吸收特性由于蛋白质和核酸都能吸收紫外线，蛋白质的吸收顶峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此260／280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于区分不同的病毒，比值小的多是线条病毒，比值高可能是球状病毒。

〔三〕免疫化学鉴定法1.电镜观察方法2.细胞病理学法：植物侵染病毒后会引起一系列的植物细胞病理变化，如在细胞内形成病毒内含体，影响细胞的结构等。利用显微镜技术对病毒侵染引起的细胞病理学变化进行观察来检测病毒的存在与种类。3.血清学鉴定血清学反响是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。最常用的有凝集反响、沉淀反响〔琼脂双扩散法〕、补体结合反响，酶联免疫吸附试验琼脂双扩散为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反响。当对应的抗原、抗体在半固体琼脂中相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，在适当的部位形成独立的沉淀线。免疫琼脂双向扩散是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生待异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线(图5-1)。如果所加抗原和抗体标本中分别含有假设干与血清学反响无关的抗原抗体，那么因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成假设干条沉淀线，—条沉淀线代表一对抗原抗体。因此，通过双向免疫扩散试验，用抗体(或抗原)检测未知抗原(或抗体)，可鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。左图为模式图，右图为实际试验的结果。上，两个抗原孔里含有相同的抗原，沉淀线是不分叉的;中，两个抗原孔里的抗原完全不同，沉淀线分叉;下，两个抗原孔里的抗原局部相同，沉淀线局部交叉。补体结合反响是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反响。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反响。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统〔抗体或抗原、未知抗原或抗体〕及指示系统〔绵羊细胞和溶血素〕五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。酶联免疫吸附试验〔简称ELISA〕将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反响与酶的催化放大作用相结合,既保持了酶催化反响的敏感性,又保持了抗原抗体反响的特异性,因而极大的提高了灵敏度〔三〕分子鉴定法主要有核酸杂交和聚合酶链式反响(PCR)核酸分子杂交技术具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原那么退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是使用的探针和要检测的核酸。从而测出要检测病毒的DNA序列。多聚酶链式反响(PCR)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。由于它具有强大的扩增能力,并且可与其它分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用,使其敏感性和特异性都大大增强1/8/2024选用无毒材料采用茎尖脱毒组织培养法繁殖的无毒苗，但栽植后必须及时防除传毒昆虫。选用抗病品种

选用耐病和抗病优良品种是防治病毒病的根本途径。

严格挑选无毒繁殖材料，如块根、块茎、种子、幼苗、插条、接穗、砧木等，以减少传染来源。

茎尖脱毒四、植物病毒病的防治参考文献

1.施曼玲、周雪平，植物病毒病的诊断技术，微生物学报，2000，27

2.洪健,李德葆,周雪平.植物病毒分类图谱.北京:

科学出版社,2001

3.王健华.海南省CMV黄灯笼辣椒别离物的亚组鉴定.

[硕士学位论文].海南儋州:华南热带农业大学,2004

4.张仲凯,李毅.云南植物病毒.北京:科学出版社,

2001

5.除东平,谢联辉.黄